SCF和G-CSF联合动员小鼠外周血培养间充质干细胞的生物学特性的初步研究

摘要

背景：间充质干细胞(MSC)是指一群具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、肌腱细胞甚至肝脏细胞、神经细胞等多种细胞分化潜能的多能干细胞。由于其分化的多样性及在体外易分离培养和扩增的特性使其成为组织工程学的理想种子细胞。在骨科领域具有广泛的应用前景，主要应用于骨修复和骨形成、软骨修复、肌腱和韧带组织修复等。MSC主要存在于骨髓、脂肪组织、软骨及骨组织、脐带血、胎盘中，其中以骨髓中含量最为丰富。外周血中是否存在MSC仍有很大争议。本试验通过联合应用干细胞因子(SCF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员小鼠外周血培养MSC，探索外周血MSC的培养方法和生物学特性。 目的：探讨联合利用SCF和G-CSF动员小鼠外周血培养MSC的分离、培养和扩增方法。并初步研究在体外单层培养条件下向软骨细胞方向诱导的条件，为临床上利用外周血来源的间充质干细胞修复关节软骨缺损提供前期的资料和方法。 方法：将40只4-6周龄BALB/C小鼠随机分为两组。试验组应用SCF及G-CSF动员后的小鼠外周血，2只BALB/C小鼠外周血为一份，对照组应用注射生理盐水小鼠的外周血作对照，两组均采用密度梯度离心结合贴壁法筛选MSC。用含15％胎牛血清的低糖DMEM培养液培养，48小时后首次换液，去除未贴壁细胞，以后3-5天换液一次，3周左右传代。取生长良好的细胞进行生长曲线测定、细胞周期检测、贴壁率检测、克隆形成能力检测，并应用流式细胞分析结合免疫组化方法鉴定MSC。同时利用含有转化生长因子-β(TGF-β1)的高糖DMEM培养液诱导第三代MSC向软骨细胞分化，应用免疫组化的方法检测Ⅱ型胶原的表达情况。 结果：1对照组无一份培养出MSC，试验组7份成功培养出MSC。原代MSC首次传代时间为4周左右，细胞形态趋向于多角形，传代之后细胞生长速度明显增快，经过3-5天的潜伏期后，出现5-7天的对数生长期，而后进入平台期，约3周左右传代，细胞呈均匀分布的集落样生长，形态更趋向于长梭形，细胞的均质性明显提高，传至第五代时细胞出现老化。 2细胞周期检测发现第三代的MSC中S+G2+M期的细胞占21.4％，G0/G1期的细胞约占78.6％，说明绝大多数细胞处于静止期。贴壁率检测发现24小时贴壁率达到45％，48小时贴壁率为81.5％。P0代细胞平均细胞集落形成率为1.25/106，P1、P3、P5代细胞的平均细胞集落形成率分别为21.32％，16.13％，9.63％。 37份生长良好的第三代贴壁细胞行表面标志物检测，流式细胞分析结果显示表达相关的抗原标记CD29和CD44，不表达造血细胞系的表面标志CD34和CD45。 4免疫组化显示第三代MSC的Ⅱ型胶原，层粘连蛋白(Laminin)表达为阴性，波形蛋白(Vimentin)为阳性。诱导后的MSC细胞Ⅱ型胶原表达为阳性。 结论：1利用Percoll密度梯度离心结合贴壁法分离培养经SCF和G-CSF动员后的外周血可以得到一定数量并且纯度较高的MSC。细胞在体外生长较活跃。 2外周血来源的MSC在特定培养液的诱导下可以向软骨细胞表型转化，可能成为软骨修复组织工程较理想的种子细胞来源。 3相比骨髓来源的MSC，经干细胞因子和粒细胞集落刺激因子动员后的外周血MSC存在着频度低，培养时间长的缺点。但表型与其类似，而且体外在一定诱导分化剂作用下具有向软骨细胞分化的特征。况且采集外周血具有创伤小、简单方便、患者乐于接受的众多优点。为日后的临床应用提供可能。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述不同组织来源间充质干细胞的研究进展

致谢

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