联合应用G-CSF/SCF动员、募集及调控自体骨髓衍生干细胞防治骨坏死的实验研究

摘要

本研究分为三部分：
　　 第一部分：联合应用小剂量脂多糖和大剂量甲强龙诱导兔骨坏死的实验研究
　　 目的：激素性骨坏死发生发展的病理生理机制目前还不明确，合适的实验模型是骨坏死治疗研究的基础。本实验研究设计一新型兔骨坏死模型制作方案，采用低剂量的脂多糖和高剂量的甲强龙诱导骨坏死。
　　 材料与方法：38只大白兔分为实验组和对照组，实验兔连续两次静脉注射脂多糖（LPS，10μg/kg），然后连续三次肌注甲强龙（MPS,20 mg/kg）（L-LPS×2+H-MPS×3）。组织学评估双侧股骨和肱骨近端和远端部分的病理改变。其它评估指标包括不同评估时间点的MRI 扫描、骨内压检测、血清纤溶酶原活性剂/抑制剂比值、血清胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的比值（LDL/HDL ratio）。
　　 结果：注射MPS后6 周，MRI扫描发现73.3%(22/30)兔出现骨坏死影响学改变，T1WI表现为不规则低信号，T2WI表现为不规则低信号或高信号；组织学证实，90% (27/30)兔子出现骨坏死，呈特征性骨坏死的病理学改变。其它结果包括骨髓脂肪细胞增大、骨内压增高、血液凝固异常和高脂血症。
　　 结论：总之，此改良新型骨坏死诱导模型可有效地阐明激素性骨坏死发生发展的病理生理变化，以利于骨坏死的预防和治疗研究。
　　 第二部分：粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和干细胞因子（SCF）单独及联合应用对间充质干细胞生物学行为的影响
　　 目的：本实验主要研究粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和干细胞因子（SCF）单独及联合应用对骨髓间充质干细胞(MSCs)的粘附、迁移、增殖和成骨能力的影响。
　　 材料与方法：分离、培养兔骨髓MSCs，采用流式细胞技术分析培养至第三代MSCs的谱系和表面标志表型，行细胞粘附特性测定、Transwell迁移实验、细胞增殖实验、成纤维细胞集落形成实验(CFU-F)和ALP活性测定。
　　 结果：流式检测细胞标记物示，培养至第3 代的细胞表型为CD29+/CD45-,CD105+/CD34-,CD90+/HLADR-。免疫细胞化学染色示抗波形蛋白抗体阳性。因此，据该群细胞的免疫表型可以确定该群细胞为MSCs。G-CSF或SCF诱导后骨髓基质干细胞的黏附性增强，其中G-CSF的效果优于SCF；联合应用G-CSF/SCF可显著增强骨髓基质干细胞对FN的黏附。SCF对MSCs迁移作用的潜能和效果类似G-CSF。联合应用G-CSF和SCF可导致更强烈的细胞迁移效应。G-CSF/SCF对MSCs的增殖有明显的促进作用（*P<0.05,**P<0.01），联合应用G-CSF/SCF的细胞生长状态好于两者的单用，可有效的促进细胞增殖；与MSCs形成CFU-F的数目成正性剂量效应关系。G-CSF与SCF均抑制骨髓基质干细胞的成骨分化(*P<0.05，**P<0.01)，各组各检测时间点ALP的活性均较对照组明显降低。
　　 结论：骨髓基质干细胞有诱人的应用前景，本研究发现G-CSF/SCF可抑制MSCs的分化，促进其增殖再生，其协同作用可导致重要的生物学效应。
　　 第三部分：联合应用粒细胞集落刺激因子和干细胞生长因子（G-CSF/SCF）治疗兔激素性骨坏死的实验研究
　　 目的：大量研究证实骨髓衍生干细胞（Bone marrow-derived stem cell，BMSC）可用于治疗塌陷前期股骨头坏死。本研究，我们通过建立兔骨坏死模型，评估G-CSF/SCF 动员自体BMSCs 修复激素性骨坏死的潜能。
　　 材料与方法：我们采用低剂量的脂多糖和甲强龙（L-LPS×2+H-MPS×3）建立兔骨坏死模型，分为治疗组和对照组。治疗组兔皮下注射G-CSF 100 μg/kg和SCF 25 μg/kg，连续干预5天；对照组给予等量的生理盐水。抽取血液，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清骨钙素的水平；采用磁共振（MRI）行影像学检查。采集实验动物双侧股骨和肱骨，处理成石蜡切片和硬组织切片，以进行免疫组织化学、组织学和组织形态学检测分析。
　　 结果：应用G-CSF/SCF 动员后，白细胞的平均数目和单核细胞的相对数目明显增多。G-CSF/SCF 治疗组兔血清OCN 蛋白表达明显增高。MRI检查发现，通过G-CSF/SCF 干预后，骨坏死区和修复区呈现出活性修复界面。定量分析发现，治疗组的新生血管和血管密度分别是对照组的3.3倍和2.6 倍。组织学和组织形态学证实，G-SCF/SCF组治疗4 周后，新生骨容量明显高于对照组。
　　 结论：联合应用G-CSF/SCF 动员BMSC 至骨坏死区，可促进早期骨坏死区骨的生长与修复，是治疗骨坏死值得探索的新策略。