尿路致病性大肠杆菌fimH和fimC蛋白及质粒所诱导的免疫应答

摘要

目的：大多数(>80％)尿路感染(Urinary tract infections，UTIs)是由尿路致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichiacoli，UPEC)引起的。UTI在女性中较普遍，在女性一生中约有50％机会患病。新发UTIs可用抗生素有效治疗，但往往在首次感染后1年左右复发，且呈现反复感染的特征，这给临床治疗带来了困难。 据国内外报道，多数UTIs和膀胱炎患者尿中分离出的大肠杆菌80％表达Ⅰ型菌毛。Ⅰ型菌毛蛋白是由多个亚单位组成(FimA，FimG，FimD，FimF，FimH，FimC)。有研究已阐明了Ⅰ型菌毛的FimH粘附素与UPEC侵入宿主细胞，引起膀胱炎和复发性尿路感染(recurrent UTIs，rUTIs)直接相关；而FimC蛋白在增强菌毛的免疫原上起重要作用。 UPEC产生的FimH粘附素在不同Ⅰ型菌毛表现型中是高度保守的。特异性的FimH抗体能与90％以上的表达有FimH的UPEC发生交叉反应，并且这些抗体能阻断细菌对膀胱细胞的结合。在自然感染中，FimH特异性IgG类抗体也可存在于阴道分泌物中。并且强化免疫后，分泌物中抗体水平的升高与血浆中FimH特异性IgG抗体水平一致。分泌物中的抗体水平在对抗黏膜感染的保护性反应中比血清中抗体效价更重要。已报道来自一株LJPEC的FimCH疫苗可以保护诊所分离的不同血清型的大肠杆菌(包括来自于再发感染女性病灶所分离的菌株)的攻击。本研究旨在构建以UPEC Ⅰ型菌毛编码基因fimH和fimC为目的基因的原核、真核表达质粒，并以其所表达的蛋白及DNA形式免疫小鼠，以观察fimH和fimC蛋白及质粒所诱导的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫在抵御UPEC感染中的作用。 方法：1、原核、真核表达质粒的构建：PCR反应克隆标准菌株UPEC J96(携带Ⅰ型和P型菌毛)的fimmH和fimc编码基因，将其扩增产物与质粒pMDl8-T连接，酶切、测序鉴定后，分别插入原核表达载体pGEX-4T-2和真核表达载体pcDNA3.1中，获得原核表达质粒pGEX-4T-2/fimH和pGEX-4T-2/fimC及真核表达质粒pcDNA3.1/fimH和pcDNA3.1/fimC； 2、目的蛋白的纯化：将原核表达质粒转染感受态EcoliBL-21，经IPTG诱导表达蛋白FimH和FimC，SDS-PAGE和Western blot鉴定、纯化、定量； 3、真核表达质粒的大提：分别大量扩增提纯真核表达质粒pcDNA3.1/fimH和pcDNA3.1/fimC，鉴定后定量； 4、动物免疫：将制备fimH质粒、fimC质粒、FimH蛋白和FimC蛋白肌肉注射BALB/c小鼠，第1组空白对照组(注射生理盐水)、第2组fimH质粒组、第3组fimH+fimC质粒组、第4组FimH蛋白组、第5组FimH+FimC蛋白组、第6组fimH质粒+FimH蛋白组，每只100ug/次，每次间隔10天，共免疫4次；每次免疫前取尾血收集血清，第4次免疫后间隔20天，除留血清外，每只小鼠收集尿液或膀胱冲洗液备用； 5、免疫效果检测：ELISA法检测外周血中抗FimH蛋白特异性IgG和膀胱冲洗液中的SIgA，流式细胞仪检测脾脏中CD<,3><'+>、CD4<'+>、CD<,8><'+>三种T细胞亚群的变化。 结果：1、PCR法克隆出全长为903bp的fimH和726bp的fimC基因，其核苷酸序列与GenBank中的序列同源性一致。2、成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2/fimH和pGEX-4T-2/fimC及真核表达质粒pcDNA3.1/fimH和pcDNA3.1/fimC。3、构建的原核表达质粒pGEX-4T-2/fimH及pGEX-4T-2/fimC转染BL-21经SDS-PAGE和Western Blot分析证实两种重组质粒分别诱导可表达出60KD和48KD左右的FimH和FimC的GST融合蛋白。4、经IPTG大量诱导后，得到纯度较高的融合蛋白，动物免疫结果说明FimH有免疫原性。5、DNA免疫后血清中可检测出特异性IgG，但效价较低，可检测出SIgA，脾脏中CD<,4><'+>T细胞百分含量较高(P<0.05)；蛋白免疫后血清特异性IgG较高，发生较强的体液免疫。 结论： 1、成功构建了LJPEC Ⅰ型菌毛基因fimH和fimC的原核及真核表达质粒并在Ecoli BL-21中成功表达融合蛋白； 2、fimH核酸免疫动物可引起细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫；蛋白免疫只能诱导体液免疫应答，纯化的融合蛋白能诱导免疫动物产生高效价的IgG抗体；FimC蛋白能增强FimH蛋白的免疫原性。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述大肠杆菌性尿路感染分子机制及其预防研究进展

致谢

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