癫痫预处理对戊四氮致痫大鼠海马神经元的保护作用及其机理的研究

摘要

目的：癫痫(EP)是由脑细胞异常放电引起的短暂性脑功能紊乱。癫痫患者由于长期反复痫性发作，尤其是长时间全面一强直阵挛发作时，脑细胞严重缺氧。随病程的延长，发作次数的增加，大脑神经元，尤其海马神经元，可发生变性，甚至死亡。患者逐渐出现脑功能受损症状，如记忆力减退，学习能力下降等多种认知功能障碍，严重影响患者的生存质量，部分患者病情迁延而致慢性癫痫。减轻癫痫损伤的根本措施是抑制致痫区神经元的异常放电，控制癫痫的发作，但如何保护非致痫区的神经元，使之对癫痫放电的易感性降低，增加神经元对缺氧损伤的耐受性，从而减少痫性放电的传播和癫痫发作以及神经元的损伤，也是非常重要的。 近年来，继缺血缺氧耐受现象的发现，人们开始关注癫痫预处理在神经元保护中的作用，在动物实验中发现了癫痫耐受现象，即一次轻微、短暂的痫性发作，能减轻相隔一定时间后较长时间、严重的癫痫引起的神经元损伤。有研究表明癫痫预处理保护作用机制可能与缺血耐受产生机制相似，同样涉及神经介质、受体及基因的表达等一系列过程。但以往的研究大都应用海人酸(KA)致痫大鼠预处理模型，未见戊四氮(PTZ)致痫预处理模型的报道。戊四氮作为中枢神经系统兴奋剂，本身不具有神经毒性作用，如果致痫动物出现神经元损伤，可明确判断是癫痫发作本身所致，使得结果分析更直观、简单。以往的研究表明，星形胶质细胞GFAP 表达在脑缺血缺氧耐受诱导中上调，表明星形胶质细胞在脑缺血缺氧耐受诱导中起重要作用。星形胶质细胞在脑癫痫耐受诱导中的作用有待进一步阐明。在戊四氮致大鼠癫痫持续状态模型基础上，经癫痫预处理，制作大鼠癫痫耐受模型；观察癫痫预处理对大鼠行为学、海马组织形态学及星形胶质细胞 GFAP 表达的影响，初步探讨癫痫耐受诱导的机制。 第一部分癫痫预处理对戊四氮致痫大鼠海马神经元的保护作用方法 1.动物模型 成年雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠51只，体重180～220g，实验动物随机分4组： ①对照组(n=6)：腹腔注射1.5ml生理盐水；②癫痫预处理组(n=15)：首先按60mg/kg腹腔注射PTZ溶液，以后每10分钟注射5mg/kg，至给药总量为80mg/kg，诱发大鼠短暂癫痫发作；③癫痫损伤组(n=15)：首先按65mg/kg腹腔注射PTZ溶液，10分钟后注射10mg/kg，然后每10分钟注射5mg/kg，直至给药总量为110mg/kg，诱发大鼠出现癫痫持续状态；④癫痫预处理+癫痫损伤组(n=15)：首先按癫痫预处理组给药方式腹腔注射PTZ溶液；3天后按癫痫损伤组方式腹腔注射PTZ溶液。模型制作过程中大鼠出现死亡或不符合模型要求者予以剔除并补充，以保证每组动物15只。 2.脑电图正常大鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上，放置皮质电极，待大鼠清醒后，按上述分组制作模型，描记脑电图。 3.大鼠行为学观察PTZ腹腔注射后观察大鼠行为学变化，记录首次RacineⅣ～Ⅴ级发作的潜伏期及Ⅳ～Ⅴ级发作持续时间。 4.大鼠海马CAl、CA3区组织形态观察大鼠末次给药后7天断头取脑，石蜡切片进行硫堇染色，于光学显微镜下观察海马CA1、CA3区组织形态并对其组织学改变进行分级(0级：无神经元死亡；1级：散在神经元死亡；2级：成片的神经元死亡；3级：几乎全部的神经元死亡)，取双侧平均等级作为统计值。高倍镜下计数海马CA1、CA3区每1mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数7个区段取平均数为神经元密度(ND)。 第二部分癫痫预处理对大鼠海马星形胶质细胞GFAP表达的影响方法 1.动物模型 成年雄性SD大鼠24只，体重180～220g，随机分为4组：①对照组(n=6)：腹腔注射1.5ml生理盐水；②癫痫预处理组(n=18)：首先按60mg/kg腹腔注射PTZ溶液，以后每10分钟注射5mg/kg，至给药总量为80mg/kg，诱发大鼠短暂癫痫发作。根据癫痫预处理后取材时间点的不同进一步分为1d、3d、5d组(每组n=6)，分别于癫痫预处理后1d、3d、5d取材。 2.大鼠海马GFAP免疫组织化学染色 应用免疫组化SP法观察大鼠海马GFAP的表达。癫痫预处理后，于相应时间点麻醉大鼠取脑，切片经抗原修复、羊血清封闭后，加GFAP抗体，再经二抗、三抗孵育，DAB显色后置显微镜下观察记录。 结论： 1.戊四氮对大鼠的致痫程度与戊四氮剂量有关。 2.癫痫预处理可以使戊四氮损伤大鼠致痫程度降低，海马神经元损伤明显减轻，即癫痫预处理能够诱导癫痫耐受。 3.癫痫预处理后大鼠海马星形胶质细胞GFAP表达上调，提示星形胶质细胞在癫痫耐受诱导中有重要作用。

目录

论文说明:英文缩写

摘要

引言

第一部分癫痫预处理对戊四氮致痫大鼠海马神经元的保护作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分癫痫预处理对大鼠海马星形胶质细胞GFAP表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 癫痫损伤机制的研究进展

致谢

个人简历