基质金属蛋白酶基因多态性及表达在子宫内膜异位症发病机制中作用的研究

摘要

子宫内膜异位症是一种良性但具有侵袭与转移生物学行为的妇科疾病。调查表明，30～40岁妇女的患病率据保守估计为25％，且近年来呈明显上升趋势，其中30％～50％合并不孕。尽管有包括手术在内的多种方法可以治疗子宫内膜异位症，但结果却并不满意，无论经过何种治疗，其5年内的复发率均在40％以上。究其原因，乃是该疾病的病因学和病理发生学尚未完全阐明，治疗的针对性不强。 由于子宫内膜异位症在组织学上表现为异位内膜组织可以出现在子宫以外的全身多处，与恶性生物学行为相似，因而，子宫内膜异位症发生的关键因素可能与恶性肿瘤相似。目前普遍认为子宫内膜细胞在盆腔种植生长需经历三个主要阶段：细胞黏附一细胞外基质重建一血管生成，相似于肿瘤的侵袭转移过程。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)在细胞外基质重建中起重要作用。 MMPS是一个高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族，可降解细胞外基质的大多数蛋白。在生理条件下，MMPs 即存在于多种正常细胞中，但表达量极少，而在炎性细胞因子、激素、生长因子刺激下和细胞转化过程，其表达量上升，此过程涉及人体多种生理和病理过程，如炎症、胚胎发生、血管形成、肿瘤侵袭转移等。在人的正常子宫内膜组织中，不同的MMPs 在月经周期中的表达不同，子宫内膜间质可表达数种MMPs，这些酶可能参与子宫内膜重建、囊胚种植及滋养层浸润。但研究发现在子宫内膜异位症患者的异位内膜中也表达多种MMPs蛋白，且部分MMPs在异位内膜中表达水平明显高于在位内膜组织，并不受月经周期的影响。MMPs 在子宫内膜异位症的发生发展中起重要作用。迄今为止，MMPs在子宫内膜异位症患者异位内膜中过度表达的机制尚不十分明确。目前真核生物的基因表达调控研究主要以研究转录调控为主，研究其表达调控，从分子水平上阐明疾病的发生机理和细胞的重要功能，为疾病的防治提供理论依据。越来越多的研究表明基因多态性在基因的转录调控中起重要作用，可能与一些疾病的易感性相关。 因此本课题选择了与基因转录活性调控相关的4个IVIMPs基因的多态性位点，研究基因多态性和其表达与子宫内膜异位症发病的关系。我们的研究内容包括：(1)比较MMP-1、3、7、9在子宫内膜异位症患者在位子宫内膜和异位内膜组织中表达的差异。(2)分析存在于MMP-1、3、7、9基因启动子区的单核苷酸多态性(singlenlMeotide polymorphism，SNP)与子宫内膜异位症发病风险的关系。(3)分析与子宫内膜异位症发病相关的基因多态性与其mRNA、蛋白在患者在位内膜组织中表达的关系。通过以上研究探讨MMP-1、3、7、9 四种基因在子宫内膜异位症发病中的作用，从遗传差异上阐明该病的发生机制，寻找子宫内膜异位症可能的MMPs遗传易感基因。 第一部分子宫内膜异位症患者在位子宫内膜和异位子宫内膜MMP表达的比较研究 目的：检测子宫内膜异位症患者在位宫内膜和异位组织中MMP-1、3、7、9表达的差异，探讨MMP蛋白表达在子宫内膜异位症发生和发展中的作用。 方法：采用流式细胞检测技术检测20 例子宫内膜异位症患者在位宫内膜和40例异位组织MMP-1、3、7、9基因表达。t 检验分析在位宫内膜与异位组织4种MMPs基因的表达差异。 结果：1)子宫内膜异位症患者在位宫内膜组织MMP-1 蛋白表达量为1.00±0.13，异位组织MMP.1蛋白表达量为1.09±0.16，两者相比具有统计学差异(P<0.05)。2)子宫内膜异位症患者在位子宫内膜组织：MMP-3蛋白表达量为1.00±0.22，异位组织MMP-3蛋白表达量为1.29±0.23，两者相比具有统计学差异(P<0.05)。3)子宫内膜异位症患者在位子宫内膜组织MNiP-7蛋白表达量为1.00±0.16，异位组织MMP-7 蛋白表达量为0.94±0.20，两者相比无统计学意义(P>0.05)。4)子宫内膜异位症患者在位子宫内膜组织MMP-9蛋白表达量为1.00±0.13，异位组织MMP-9蛋白表达量为1.04±0.11，两者相比无统计学意义(P>0.05)。 结论：首次采用流式细胞检测方法分析了子宫内膜异位症患者在位宫内膜和异位组织的MMP-1、3、7、9的蛋白表达，结果表明：1)子宫内膜异位症患者的异位内膜中MNiP-1 和MMP-3 蛋白表达明显高于在位内膜，表明MMP-1、3蛋白的异常表达可能与子宫内膜异位症的发生和发展有关。MMP-1为胶原酶，MMP-3 为间质溶素，二者的高表达均可增加细胞外基质的降解能力，所以异位组织中MMP-1、3的高表达可能表明细胞降解细胞外基质的能力增强，与组织的重建、出血及种植有关。2)子宫内膜异位症患者的在位和异位内膜中MMP-7 和MMP-9蛋白表达无明显差异。 第二部分基质金属蛋白酶基因多态性与子宫内膜异位症发病风险关系的研究 目的：通过分析子宫内膜异位症患者和对照组妇女人群MMPs 基因多态性位点基因型频率和等位基因频率的差异，探讨。MMPs 基因多态性与子宫内膜异位症发病风险的关系。 方法：采用病例.对照研究方法，以外周血白细胞 DNA 为实验材料，通过聚合酶链反应.限制内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析了143例子宫内膜异位症患者和160位健康妇女对照的MMP-1基因启动子区-1607 1G/2G、MMP-3 基因启动子区.1171 5A/6A、MMP-7基因启动子区-181 A/G和MMP-9基因启动子区-1562 C/T。多态性位点的基因型频率分布情况。t 检验分析病例及对照组年龄差异；x2 检验分析两组人群MMP-1、3、7、9等位基因及基因型频率分布的差异，以非条件Logistic回归方法计算表示相对风险度的比值比(odds ratio，OR)及其95％可信区间(confidence interval，CI)。EH软件分析基因多态性单体型频率。2LD软件分析等位基因连锁不平衡状态。 第三部分子宫内膜异位症患者子宫内膜组织MMP-1 和MMP-7 基因mRNA和蛋白表达与基因多态之间的关系 目的：探讨MMP-1和MMP-7 基因启动子区多态性与基因mRNA和蛋白表达水平之间的关系。 方法：采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测30例携带MMP-1、MMP-3 不同基因型的子宫内膜异位症患者的在位内膜组织 2 种基因mRNA的转录活性。采用免疫组织化学方法检测了MMP-1、MMP-3 不同基因型的子宫内膜异位症患者的在位内膜组织2种基因蛋白表达水平。秩和检验比较不同基因型的在位内膜组织mRNA和蛋白表达差异。 结论：首次研究证实MMP不同基因型携带者的妇女宫内膜组织相关基因转录活性和蛋白的表达可能不同，其结果可能导致不同个体在位内膜的差异，从而造成发病风险的不同。1)携带MMP-1 基因1G/2G多态位点不同基因型的子宫内膜异位症患者在位子宫内膜组织MIVIP-1 mRNA和蛋白的表达强度不同，即2G/2G基因型的携带者MMP-1基因mRNA和蛋白的表达明显高于其它基因型(1G/1G和1G/2G)的携带者，表明MMP-12G等位基因可能通过增加基因的转录活性导致在位子宫内膜MMP-1 蛋白表达的增加。2)携带MMP-7基因A/G多态位点不同基因型的子宫内膜异位症患者在位子宫内膜组织MMP-7 mRNA 和蛋白的表达强度不同，即G等位基因的携带者在位子宫内膜组织MNIP-7 mRNA 和蛋白的表达明显增强，说明MMP-7的G等位基因可能通过增加基因的转录活性导致在位子宫内膜MMP-7 蛋白表达的增加。 总之，通过本课题的研究我们进一步证实了MMPs 基因在子宫内膜异位症的发生和发展中起重要作用。且推测不同的MMPs 基因在子宫内膜异位症发生和发展的不同阶段作用不同，MMP-1 基因的遗传差异所导致的个体差异与子宫内膜异位症发病风险的个体差异相关，其蛋白的异常表达还可能与子宫内膜异位症的进展相关；MMP-3 基因的异常表达在子宫内膜异位症的发展中起重要作用；MMP-7作为一个上皮性表达的蛋白，可能对子宫内膜异位症的发生起重要作用，带有MMP-7 高表达的在位子宫内膜细胞更易在经血逆流中“异位”种植，增加个体子宫内膜异位症的发病风险；MMP-9 虽然在本研究中没有被证实与子宫内膜异位症的发生和发展有相关性，但鉴于其它相关研究，有待于从其它方法证实MMP-9在子宫内膜异位症进展中的作用。

目录

论文说明：英文缩写

摘要

引言

第一部分子宫内膜异位症患者在位子宫内膜和异位子宫内膜MMPs表达差异的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分基质金属蛋白酶基因多态性与子宫内膜异位症发病风险关系的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分子宫内膜异位症患者子宫内膜组织MMP-1和MMP-7基因mRNA和蛋白表达与基因多态之间的关系

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一：基质金属蛋白酶和子宫内膜异位症

综述二：子宫内膜异位症遗传易感基因的研究

致谢

个人简历