过度训练致急性肾损伤的分子机制及解痉抗炎抗氧化中药的防治作用

摘要

目的：过度训练是由于运动训练负荷过大，超过机体的承受能力，导致多器官功能紊乱的病理状态。近年来，过度训练引起脏器损伤的研究受到重视，但过度训练引起急性肾损伤(overtraining-ind’uced acute kidneyinjur,OTIKI)的研究工作不多，进展不大，有关OTIAKI的特征及其发病机制还不清楚。近年研究发现，肾组织细胞凋亡参与了运动性蛋白尿的发生，但肾组织细胞凋亡在OTIAKI中的作用及其发生的分子机制尚未阐明，对OTIAKI的防治在临床上尚缺乏有效的药物。中药唐古特莨菪提取物山莨菪碱具有解除血管痉挛、改善微循环的作用，对缺血性急性肾衰竭具有防治作用；从欧亚旋覆花提取的有效成分旋覆花素可通过抗炎信号转导途径影响细胞的凋亡；苦碟子的有效成分可通过清除自由基和抗氧化作用防治缺血再灌注损伤。这三种药物对各种原因引起的组织缺血、缺氧和细胞凋亡具有拮抗作用，但它们是否能防治OTIAKI及其防治OTIAKI的分子机制尚未见文献报道。 本研究通过让大鼠游泳至力竭，建立大鼠过度训练致急性肾损伤模型，采用多种实验技术，分别检测各组大鼠肾功能及肾组织结构的改变以及肾组织细胞凋亡及凋亡相关基因表达的变化；从多层次研究了OTIAKI时肾损伤的病理特征及其发病机制，阐明肾损伤过程中肾细胞凋亡的诱发因素、基因调控及细胞内信号转导途径，观察山莨菪碱、旋覆花素和苦碟子对OTIAKI的防治作用及其分子机制，加深对OTIAKI发病机制的认识，寻求新的治疗靶位点，为临床OTIAKI的防治提供新的理论依据和措施。 方法：将80只雄性Wistar大鼠(体重200～220g)随机分为安静对照组(control，CN，n=8)、力竭运动组(exhaustive swimming，ES，n=24)、山莨菪碱干预组(Anisodamine，AD，n=16)、旋覆花素干预组(InulaBritannica，IB，n=16)、苦碟子干预组(Ixeris Sonchifolia，IS，n=16)。CN组为安静对照；ES组又根据力竭后恢复时间分为力竭后即刻(ESI)、力竭后6h(ES 6h)和力竭后24h(ES 24h)；AD组于力竭运动前20 min腹腔注射山莨菪碱10 mg/kg后进行力竭运动，分为AD 6h和AD 24h组；IB组于力竭运动前24h分三次口腔灌入旋覆花素25 ml/kg(含ABL65mg/kg)后进行力竭运动，分为IB 6h和IB 24h组；IS组于力竭运动前20min腹腔注射苦碟子注射液20 g/kg(含总黄酮8 mg/kg和腺苷0.05 mg/kg)后进行力竭运动，分为IS 6h和IS 24h组。每个时间点8只大鼠。采用大鼠游泳至力竭建立过度训练致急性肾损伤模型；用日立7170A全自动生化分析仪检测各组大鼠血清肌酐(Cr)、尿素(Ur)、磷酸肌酸激酶(CK)及尿γ-谷氨酰胺转肽酶(γ-GT)；光镜及电镜观察各组大鼠肾组织结构的改变：TUNEL法及流式细胞术检测各组大鼠肾组织细胞凋亡；免疫组化法及流式细胞术检测各组大鼠肾组织NF-KB、Fas-L、Caspase-8、Caspase-9的变化；免疫组织化学法检测各组大鼠肾组织TNF-α、Bax、Bcl-2、Bid及E-Cadherin蛋白的表达；黄嘌呤氧化酶法测定血清和肾组织中SOD的活力，用硫代巴比妥酸法测定血清和肾组织中MDA的含量。实验数据用均数±标准差(X±s)表示，用SPSS 12.0软件包进行统计学分析，组间差异用单因素方差分析，以P<0.05为有统计学意义。 结论： 1 过度训练大鼠出现肾功能及肾组织形态学损伤，这种损伤以细胞凋亡占细胞损伤的主体，提示肾组织细胞凋亡既是OTIAKI的损伤特征，也是OTIAKI的关键发病机制，及时采取药物干预是OTIAKI防治的关键。 2 过度训练可通过增强氧化应激反应，破坏肾组织Bax/Bcl-2的平衡，上调炎症信号通路及Caspase凋亡相关信号通路中关键信号蛋白的表达，强化凋亡信号转导进而诱导肾组织细胞凋亡，还可使肾组织E-cadherin降解和丢失，导致急性肾损伤。 3 山莨菪碱、旋覆花素和苦碟子可通过抗氧化应激反应，调控肾组织Bax/Bcl-2的平衡，下调凋亡相关信号蛋白的表达，抑制肾组织E-cadherin的降解和丢失而阻滞过度训练所致的肾组织细胞凋亡，减轻急性肾损伤，明显提高大鼠的运动能力。三种药物对OTIAKI均具有良好的肾脏保护作用，在作用效果上，山莨菪碱、旋覆花素比苦碟子更明显，这可能与它们作用的分子靶点及其作用程度不同有关。

目录

论文说明：英文缩写

摘要

引言

第一部分过度训练致大鼠急性肾损伤的结构特征及炎症细胞因子和NF-KB的作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子对过度训练大鼠急性肾损伤的防治作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分过度训练大鼠肾组织细胞凋亡的基因调控机制及山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子干预的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分Caspase凋亡相关信号传导通路在过度训练致大鼠肾组织细胞凋亡中的作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第五部分山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子多靶点防治过度训练大鼠肾组织细胞凋亡分子机制的实验研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述：近年来过度训练致脏器损伤的研究概况

致谢

个人简历