细胞色素C和Caspase-3在过度训练致大鼠急性肾损伤中的作用及山莨菪碱干预作用的研究

摘要

目的：近年来由于过度训练引起急性肾损伤(overtraining-inducedacute kidney injury，OTIAKI)的发病率逐年增高，过度训练也作为一种常见的运动性疾病越来越受到国内外学者们的重视，但目前有关OTIAKI的发病机制尚未完全阐明，还缺乏有效的防治措施。本课题组既往的研究证实，细胞凋亡是过度训练致急性肾脏损伤的主要发病机制，但对过度训练导致急性肾损伤时的细胞凋亡信号转导通路缺少足够的认识。本研究通过让大鼠游泳至力竭，建立大鼠过度训练致急性肾损伤模型，观察过度训练大鼠肾组织细胞色素C和Caspase-3的表达，及山莨菪碱对上述蛋白表达的影响，旨在探讨肾组织细胞凋亡的线粒体通路及山莨菪碱的可能保护机制，为OTIAKI的防治提供新的靶点。
　　方法：
　　(1)清洁级雄性SD大鼠48只，体重180-220g，按随机数字表随机分为三组：安静对照组(CN，n=8)、力竭运动组(ES，n=24)、山莨菪碱干预组(AD，n=16)。安静对照组(CN)未进行力竭运动，不注射任何药物；力竭组又根据力竭后恢复时间不同分为力竭后即刻组(ESI)、力竭后6小时组(ES6h)和力竭后24小时组(ES24h)三个亚组，且各亚组大鼠在运动前20min给予灭菌注射用水10mg/Kg一次性腹腔注射；山莨菪碱干预组也根据力竭后恢复时间不同分为山莨菪碱6h组(AD6h)和山莨菪碱24h组(AD24h)两个亚组，各亚组大鼠于运动前20min给予山莨菪碱注射液10mg/Kg一次性腹腔注射。每个时间点均为8只大鼠。采用大鼠无负重单次游泳至力竭建立过度训练引起急性肾损伤模型。
　　(2)于各时间点，5％的水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，摘取两侧肾脏，将左侧肾脏放入EP管，迅速放入液氮中，-80℃冰冻保存，待用于Westem blot技术检测肾组织细胞色素C和Caspase-3的表达。右侧肾脏置于4℃4％多聚甲醛中固定，制作石蜡切片。
　　(3)采用HE染色光镜下观察肾组织形态学变化。
　　(4)采用免疫组化染色(PV法)观察肾组织细胞色素C和Caspase-3的表达情况，并应用图像分析系统对免疫组化结果进行半定量分析。
　　(5)应用Western blot技术检测肾组织细胞色素C和Caspase-3的表达。
　　(6)统计分析：所有实验数据均采用SPSS13.0软件包进行统计学处理，实验数据均以均数±标准差(x±s)表示。组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)分析，以p＜0.05认为有统计学意义。
　　结果：
　　(1)无负重单次游泳至力竭后大鼠表现为极度疲劳的神态，精神萎靡，对外界刺激反应迟钝，胸腹着地，无法站立，活动困难，严重者可有球结膜出血的现象。力竭运动组大鼠约2h后方可自由活动，进食水情况欠佳，而山莨菪碱干预组大鼠约20min后可自由活动，基本可正常进食。
　　(2)HE染色病理组织学观察：正常对照组大鼠肾组织细胞结构变化不明显。力竭后即刻组和力竭后6h组肾组织细胞结构仅有轻微改变，极少部分的肾小球球囊及小管扩张，肾小管上皮细胞出现空泡化；可见力竭后24h组大鼠肾组织结构改变明显，肾小管上皮细胞的刷状缘出现不规整甚至脱落的改变。山莨菪碱组力竭的大鼠各时间点的病理变化均较力竭大鼠肾组织病理变化轻。
　　(3)免疫组化结果显示：①细胞色素C的表达：阳性细胞表达为细胞胞浆着棕黄色，多位于皮髓交界和髓质的肾小管，肾小球及间质未见表达。正常对照组细胞色素C弱表达，ESI、ES6h、ES24h表达逐渐增强，ES24h达到高峰(P＜0.05)，各力竭组均较正常对照组增强(P＜0.05)。山莨菪碱各亚组肾组织细胞色素C表达与同期力竭组相比明显减弱，AD6h、AD24h肾组织细胞色素C表达与同期力竭组间具有统计学差异(P＜0.05)。②Caspase-3的表达：正常对照组大鼠肾组织Caspase-3目弓表达，ESI、ES6h、ES24h表达逐渐增强，ES24h达到高峰(P＜0.05)，各力竭组均较正常对照组增强(P＜0.05)。山莨菪碱各亚组肾组织Caspase-3表达与同期力竭组相比明显减弱，AD6h、AD24h肾组织Caspase-3表达与同期力竭组间具有统计学差异(P＜0.05)。
　　(4)WesternBlot法检测结果：①细胞色素C的表达：CN组(2.055±0.375)肾组织细胞色素C的表达最弱，ESI(2.665±0.329)，ES6h(3.316±0.343)和ES24h(3.808±0.517)表达逐渐增强，ES24h表达最强。AD6h(2.475±0.336)，AD24h(3.195±0.268)细胞色素C蛋白表达较同期ES组的明显减弱，各组间差别具有统计学意义P＜0.05。②Caspase-3的表达：正常对照组(0.140±0.022)肾组织Caspase-3蛋白的表达最弱，ESI(0.295±0.019)，ES6h(0.636±0.041)和ES24h(1.150±0.017)表达逐渐增强，ES24h表达最强。AD6h(0.384±0.022)，AD24h(0.905±0.027)组Caspase-3蛋白表达较同期ES组的明显减弱，各组间差别均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论：
　　(1)细胞色素C和Caspase-3共同参与了过度训练致肾组织细胞凋亡的发生，提示线粒体凋亡通路可能是过度训练大鼠肾组织细胞凋亡的重要信号转导通路；
　　(2)山莨菪碱可以减少肾组织细胞色素C和Caspase-3的表达，提示山莨菪碱可以抑制细胞线粒体凋亡通路来减轻过度训练大鼠肾组织细胞凋亡，起到肾脏保护作用。