微孔板杂交法对肾综合征出血热早期诊断的应用研究

摘要

目的：探索建立一种敏感特异的早期诊断肾综合征出血热的检测方法。 方法： 1.从河北省各医院采集临床诊断为肾综合征出血热病人的急性期血清，用间接免疫荧光法(IFA)检测血清中IgG抗体； 2.用间接免疫荧光法检测到的阳性鼠肺标本经漂洗、研磨、过滤后制成病毒上清； 3.从病毒上清或IFA检测王HFRS阳性的病人血清中提取汉坦病毒的总RNA，以RNA为模板，参考汉坦病毒的保守序列设计引物并进行逆转录获得相应的cDNA； 4 采用标记有生物素的上游引物经套式PCR进行扩增； 5 扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定或用标记地高辛的探针进行液相杂交，将杂交产物固定于包埋链酶亲和素的微孔板中，经酶标抗地高辛抗体结合，底物显色，对杂交结果进行鉴定。 结果： 1.实验方法的建立1.1 最佳反应浓度的确定参照有关文献，用方阵法来确定最佳反应条件。以病毒上清为标本，测定不同物质、不同浓度的OD值，计算出病毒上清OD值与空白对照OD值平均值的比值，取比值最大值时的条件作为最佳反应条件。最终确定的最佳反应条件是：链霉亲和素浓度为10mg/L，探针浓度为1.5μmol/L，抗地高辛碱性磷酸酶稀释度为1:2500。 1.2 最佳反应时间的确定随温育时间不同，实验最后目测颜色也不同，在一定时间内随温育时间延长，目测颜色加深(由无色变为黄色)，OD值增大。实验结果取值时，以阳性数值在0.8～2.0之间，空白对照OD值小于0.2，且阳性标本的OD值和空白对照的OD值的平均值的差较大为标准来确定温育时间的长短。此次实验温育时间是1小时。 1.3 酶联免疫吸附试验阴阳性界限的判定设置3孔空白对照作参照，计算空白对照OD值的平均值和标准差，截断值(Cut-off)是空白孔的平均值加3倍的标准差。标本的OD值大于截断值，则判为阳性；如标本的OD值小于截断值，可判为阴性；如标本的OD值在截断值附近，则重复做3孔，取3孔OD值的平均值最后确定结果。 2.方法学评价2.1 敏感性当扩增产物稀释1000倍时，微孔板杂交法仍能判为阳性；而用凝胶电泳法检测，当扩增产物稀释10倍时，目的条带变得很弱，表明微孔板杂交法的敏感性为琼脂糖凝胶电泳法的100倍。 2.2 特异性取健康人血清20份，非HFRS的发热病人血清16份，乙肝病人血清2份进行同步扩增，凝胶电泳分析未见目的片断，扩增产物继续进行液相杂交，将杂交产物固定于包埋链酶亲和素的微孔板中，经酶标抗地高辛抗体结合，底物显色，对杂交结果进行鉴定，测定的OD值均小于Cut-off值，可判为阴性。结果表明，微孔板杂交法具有较高的特异性。 2.3 重复性同一份病毒上清，在同一时间进行4管的微孔板杂交实验，批内实验均值为1.214，标准差为0.076，变异系数为0.063；同一份病毒上清，在不同时间1天，2天，7天，1个月，3个月，6个月分别进行微孔板杂交实验，测定6次，批间实验均值1.484，标准差0.311，变异系数为0.210。OD值均大于Cut-off值，结果均可判为阳性，表明该方法具有较好的重复性。 3.检测方法的应用3.1 血清标本IFA的检测2007年共收集河北省各医院临床诊断HFRS病例血清标本89份，经IFA检测血清中IgG抗体，其中阳性31份。 3.2 不同病程的HFRS患者血清标本琼脂糖凝胶电泳法检测取王IFRS阳性血清31份，进行RNA的提取，分别用Ⅰ型、Ⅱ型特异型引物进行套式PCR。扩增产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果有5份血清用Ⅱ型引物扩增出目的条带，阳性率为16.13％，用Ⅰ型特异型引物均未出现目的条带。 3.3 不同病程的HFRS患者血清标本微孔板杂交法检测对扩增产物用标记地高辛的探针进行液相杂交，然后将杂交产物固定于包埋链酶亲和素的微孔板中，经酶标抗地高辛抗体结合，底物显色，对杂交结果进行鉴定。共11份血清的OD值大于Cut-off值可判断为阳性，阳性率为38.71％。 3.4 不同病程的HFRS患者血清标本琼脂糖凝胶电泳法与微孔板杂交法检测结果比较微孔板杂交法检测阳性的11份血清均为用Ⅱ型引物扩增出的产物，其中电泳出现目的条带的5份血清均判为阳性，说明两种方法具有很好的一致性。且微孔板杂交法的阳性检出率高于琼脂糖电泳法。 结论： 1.成功建立了用于HFRS患者早期诊断的敏感性的方法：微孔板杂交法。 2.微孔板杂交法检测HFRS病毒上清的敏感性是琼脂糖凝胶电泳法的100倍，该方法特异性高、重复性好。 3.应用微孔板杂交法检测HFRS患者的阳性率高于琼脂糖凝胶电泳法，特别是早期患者。 4 微孔板杂交法可用于HFRS的早期诊断，但需进一步完善.

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 肾综合征出血热的早期诊断

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