冠心病心绞痛中医证候量化辨证标准及络气虚滞型动脉粥样硬化大鼠模型病理生理学基础研究

摘要

目的: 本研究以生物-心理-社会医学模式下社会心理应激因素致病作用目益受到重视为背景，以中医络病理论为指导，通过临床流行病学调查建立定性与定量相结合的冠心病心绞痛证候辨证标准，基于证候组合与分布规律探讨络气变化在冠心病心绞痛病机演变中的作用；依据证候辨证标准建立络气虚滞证候模型及络气虚滞型动脉粥样硬化(As)大鼠模型，并综合评价，探讨其代谢物谱特征；研究模型大鼠神经内分泌免疫(NEI)网络相关因子变化规律及其与As病变的关系；离体观察与络气虚滞证候因素相关的血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)促大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的信号通路机制及通络药物干预作用。基于上述临床与基础研究探讨络气虚滞证候因素对As病变的影响，为研究社会心理因素作用提供实验依据，并初步揭示络气虚滞证候的病理生理学基础，同时佐证络病理论科学价值。 方法: 本文包括四部分研究: 1. 冠心病心绞痛中医证候量化辨证标准研究 1.1 冠心病心绞痛临床流行病学调查 以文献研究和专家咨询为基础，确定调查与冠心病心绞痛相关的中医证候信息并予以综合分级量化，制定临床调查表，选择北京、上海、广州、济南、沈阳、长春等地8个调查中心，开展多中心大样本冠心病心绞痛患者中医证候临床流行病学现况调查。调奄过程中严格质量控制，保证调查数据真实可靠。 1.2 冠心病心绞痛量化辨证标准的建立 对收集的符合入选与排除标准的403例冠心病心绞痛患者，按3:1分为运算组(302名)和考核组(101名)。采用基于熵的复杂系统分划方法(entropy-based complex systems partition method，ECSPM)提取运算组302例患者症状信息，计算症状贡献度，运用诊断性试验受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve，ROC)分析建立证候辨证阈值，形成量化辨证标准。以考核组101例患者进行辨证标准的前瞻性检验。 1.3 冠心病心绞痛中医证候组合与分布规律研究 以ECSPM进行冠心病心绞痛证候关联度分析，计算各证候在全部冠心病心绞痛患者中所占比例，根据关联度分析及证候分布情况探讨其病机特点。 2. 络气虚滞型As大鼠模型的建立及其评价 以建立的络气虚滞证辨证标准为依据，根据中医“劳则气耗”理论，以“基础饮食+负重游泳”建立络气虚滞证候模型，以维生素D3灌胃、高蛋氨酸和高脂饲料喂养建立As模型，以两种造模因素叠加建立络气虚滞型大鼠As模型(复合模型)。Wistar大鼠随机分为7组：①正常对照组。②As模型组。③络气虚滞组(负重游泳组)。④络气虚滞型As模型组(复合模型组)。⑤通心络大剂量组。⑥通心络小剂量组。⑦辛伐他汀组。以一般状况观察及表征半定量评分、力竭游泳时间、悬杆及旷场实验、电生理检测客观评价络气虚滞主要证候信息(乏力、气短、神疲、心悸症状)在模型大鼠的表现；以主动脉光镜及电镜形态学观察、免疫组化技术α-肌动蛋白(α-actin)标记染色、血中总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)检测评价As病变程度；以代谢组学技术分析大鼠血浆代谢物谱变化。 3. 络气虚滞型As大鼠NEI网络相关因子变化及通心络干预研究 以建立的络气虚滞模型、As模型及复合模型大鼠为研究对象，探讨络气虚滞状态下NEI网络相关因子变化规律及其对As病变的影响。动物分组及干预同上，实验结束后麻醉大鼠经颈动脉插管采集血液标本，分离血浆或血清，检测下丘脑-垂体-肾上腺轴指标(hvoothalamo-pituitary-adrenal axis，HPAA)：下丘脑组织促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)、血浆促肾上腺皮质激素(adrenocorticotrop(h)ic hormone，ACTH)和血清皮质酮(corticosterone，CORT)(放射免疫分析法)，交感肾上腺髓质：血清去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、肾上腺素(epinephrine，E)(ELISA法)，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone svstem，RAAS)：血浆肾素活性(plasma renin activity、 PRA)、醛固酮(aldosterone，ALD)、血浆及组织Ang Ⅱ(放射免疫分析法)，细胞因子：血清白介素(interleukin，IL)-6(放射免疫分析法)、干扰素(interferon，IFN)-γ(ELISA法)；留取大鼠胸主动脉常规制作石蜡组织切片，免疫组化技术检测主动脉增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)蛋白表达。 4. Ang Ⅱ对大鼠VSMCs增殖影响的信号转导机制及通心络干预作用研究 选择络气虚滞证候因素干预引起NEI网络紊乱的主要效应因子AngⅡ，探讨其对体外培养大鼠VSMCs增殖影响的信号转导机制及通心络干预作用，为证候因素干预血管病变的作用机制提供实验依据。采用组织贴块法培养原代大鼠VSMCs，通过MTT法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞周期，激光共聚焦显微镜观察STAT3核转位，Westemblot检测Janus激酶(Janus Kinase，JAK)2、信号转导和转录激活因子(signaltransducer and activator of transcription，STAT)3蛋白及其磷酸化蛋白表达，以JAK2特异性抑制剂AG490和辛伐他汀做对照，探讨AngⅡ对VSMCs增殖影响的信号转导机制及通心络干预作用。 结论： 1. 本研究以络病理论为指导，以文献研究、专家咨询为基础，通过多中心、大样本临床流行病学调查建立冠心病心绞痛证候辨证标准，运用基于熵的复杂系统分划方法从原始症状无监督分析入手，建立量化证候辨证标准，避免单纯依靠文献研究或专家经验所致主观偏倚；由于构成证候的症状之间存在着非线性复杂关系，该方法较之既往研究中采用的处理线性关系方法更为准确的反映了症状间相互作用的复杂关系，为建立证候模型并探讨其病理生理学基础奠定基础。 2. 基于证候组合与分布规律探讨冠心病心绞痛病机特点，研究结果显示络气郁滞或络气虚滞与血瘀、痰浊(热)、郁热、阴虚、阳虚等证候形成较强的关联关系，而络气郁滞或络气虚滞存在于所有冠心病心绞痛患者，所占比例高于血瘀、痰浊(热)、郁热、阴虚、阳虚等证候所占比例，显示络气变化所致郁滞或虚滞为冠心病心绞痛的始发病因并贯穿病变全过程，而国内医学界几十年来所重视和研究的血瘀、痰浊(热)等因素为冠心病心绞痛的继发致病因素。从络气切入研究冠心病心绞痛不同于已有从血瘀、痰浊切入开展的研究，显示了气血相关的络病理论特色，对生物-心理-社会医学模式下探讨各种社会心理因素的致病作用具有重要指导意义。 3. 以建立的络气虚滞证候辨证标准为依据，以“基础饮食+负重游泳”建立络气虚滞大鼠模型，从大鼠一般状况观察、生物学表征半定量评分、力竭游泳时间、悬杆实验、行为学观察、电生理检测客观评价模型大鼠络气虚滞证主要症状乏力、神疲、气短、心悸与标准一致性，也是本研究的特色之一。以As大鼠模型叠加“基础饮食+负重游泳”建立病证复合动物模型，模型大鼠既具有早期纤维增生性As的局部病理特点，又表现出络气虚滞宏观证候，代谢组学方法分析显示3种模型代谢物谱存在明显差异，这为探讨其病理生理学基础及络气虚滞证候因素对As病变的影响奠定了基础。 4. 探讨络气虚滞型As大鼠模NEI网络相关因子变化规律，络气虚滞证候状态下下丘脑-垂体-肾上腺轴调节功能紊乱、交感肾上腺髓质与肾素-血管紧张素-醛固酮激活，而As模型没有显著变化。络气虚滞证候因素使复合模型NEI网络相关因子变化紊乱且不同程度加重的同时，又促使As病理造模因素引起的组织AngⅡ升高，总体效应表现为复合模型反映平滑肌细胞增殖的PCNA表达明显高于As模型，揭示了络气虚滞证候因素可通过引起NEI网络内相关因子调控失常影响As病变。 5. 以络气虚滞证候因素作用相关的AngⅡ为干预因子，探讨其对体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞增殖作用的影响及其相关信号转导机制。结果表明AngⅡ可明显促进大鼠平滑肌细胞增殖，与其促进细胞由G0/G1期进入S期有关。同时AngⅡ可促进平滑肌细胞p-JAK2和p-STAT3表达，促进STAT3核转位，而上述作用可被JAK2的特异性阻断剂AG490阻断，显示其促平滑肌细胞增殖作用与JAK2/STAT3信号通路有关。 6. 复方通心络和辛伐他汀对叠加证候造模因素和病理造模因素的复合模型的作用显示：二者均可改善局部病理改变，并通过作用于JAK2/STAT3信号通路抑制AngⅡ引起的血管平滑肌细胞增殖；通心络同时显著改善与络气虚滞证候因素相关的大鼠行为学、电生理等宏观表现，而辛伐他汀对证候变化基本无改善作用；特别是通心络改善络气虚滞证候因素干预之后引起的NEI网络相关因子紊乱表现出辛伐他汀不具备的整合调节作用，这对于现代生活条件下各种社会心理因素与病理因素叠加造成人体复杂病理生理现象的防治具有更广泛意义。

目录

论文说明：英文缩写

声明

摘要

引言

第一部分冠心病心绞痛中医证候量化辨证标准研究

前言

材料与方法

结果

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分络气虚滞型As大鼠模型的建立及其评价

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分络气虚滞型As大鼠NEI网络相关因子变化及通心络干预研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分AngⅡ对大鼠VSMCs增殖影响的信号转导机制及通心络干预作用研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 中医证候规范化研究的回顾与发展趋势分析

综述二 中医证候动物模型研究现状及其在脉络病变动物模型建立与评价中的应用

致谢

个人简历