槲皮素抑制血管平滑肌细胞氧化应激作用机制

摘要

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是具有氧化还原潜能的氧衍生物，包括超氧阴离子（O2·-）、过氧化氢（H2O2）、羟基（OH·）、次氯酸（HOCL）等等。适量的ROS是维持正常新陈代谢的条件之一，而体内过量的ROS则会引起组织损伤和器官功能紊乱。
　　 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide vadenine dinucleotide phosphate，NAD（P）H）氧化酶是心血管系统催化ROS生成的主要酶系，由多个亚基组成。其中p47phox亚基对于调节NAD（P）H氧化酶的活性具有重要作用。大量证据表明，NAD（P）H氧化酶在动脉粥样硬化、高血压及再狭窄等血管重塑性疾病的发生发展过程中扮演重要角色，也是多种抗氧化药物干预的靶点。
　　 槲皮素是广泛存在于多种植物中的一种黄酮类化合物，具有抗增殖、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等广泛的药理作用和生物活性。本实验观察了槲皮素对大鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）氧化应激的保护作用，从细胞水平上探讨其作用机制。
　　 方法：
　　 DHE荧光染色法观察槲皮素对VSMC中O2生成的影响；采用比色法测定细胞培养基中丙二醛（malondialdehyde， MDA）的含量和超氧化物歧化酶（superoxide dimutase，SOD）活性的变化：Western blot分析检测p47phox的表达及磷酸化水平；RT-PCR检测p47phox基因的转录活性。
　　 结果：
　　 1、槲皮素抑制H2O2诱导的VSMC中O2·-的生成
　　 DHE荧光染色结果显示，200μmol/L H2O2刺激VSMC12h后，细胞内的红色荧光强度明显增强，说明O2·-的生成增多。用50μmol/L槲皮素预处理VSMC12 h后，再用H2O2刺激细胞，细胞内的红色荧光强度减弱，接近正常水平，表明槲皮素可抑制H2O2诱导的O2·-的生成。
　　 2、槲皮素降低MDA含量，提高总SOD活性
　　 MDA含量测定结果显示，200μmol/L H2O2刺激VSMC12h后，细胞培养基中MDA含量与对照组相比明显升高，约为对照组的2.78倍（P<0.01）。用50μmol/L槲皮素预处理VSMC后，再用H2O2刺激细胞，MDA的生成受到明显抑制，与H2O2刺激组比较降低了57.5％（P<0.01），表明槲皮素可抑制H2O2诱导的MDA的生成。
　　 SOD活性测定结果显示，H2O2刺激组与对照组相比，其细胞培养基中总SOD活性下降了38.2％（P<0.01）。用槲皮素预处理VSMC后，再用H2O2刺激细胞，总SOD活性仅轻微降低，但仍明显高于H2O2处理组，约为后者的1.39倍（P<0.01），表明槲皮素可解除H2O2对总SOD活性的抑制。
　　 3、H2O2对VSMC p47phox表达的影响
　　 Western bolt结果显示，不同浓度（0、50、100、200、400μmol/L）H2O2处理VSMC12 h后，p47phox蛋白表达随H2O2浓度的增加而增高，于200μmol/L时达到峰值，在4001μmol/L时蛋白表达水平略有降低，但仍高于正常水平；给予200μmol/L H2O2处理VSMC1、3、6、12、24 h后，p47phox蛋白表达呈时间依赖性增加，于12 h达到峰值，在24 h时蛋白表达仍维持在较高水平，分别为对照组的1.08、1.21、1.43、1.79、1.62倍（P<0.01）。H2O2对p47phox表达的诱导效应具有剂量依赖性和时间依赖性。
　　 4、槲皮素对H2O2诱导的VSMC p47phox表达的影响
　　 半定量RT-PCR和Western bolt分析结果均显示显示，200μmol/L H2O2刺激VSMC12 h后，p47phox mRNA和蛋白水平明显升高，分别为对照组的1.75倍和1.79倍；而50μmol/L槲皮素预处理细胞12 h后，再用H2O2处理细胞，p47phox mRNA和蛋白水平显著降低（P<0.01），表明槲皮素对H2O2诱导的VSMC p47phox基因表达具有抑制作用。
　　 5、槲皮素抑制H2O2诱导的VSMC p47phox磷酸化活化
　　 免疫沉淀结果显示，对照组细胞中p47phox磷酸化水平相对较低，H2O2刺激VSMC15 min、30 min、1 h后，p47phox磷酸化水平快速、短暂升高，于刺激15 min时即达高峰，随后略有降低，但仍高于正常水平。槲皮素预处理VSMC12 h后，再用H2O2刺激细胞，p47phox的磷酸化水平较H2O2组下降47.2％（P<0.01）。结果提示槲皮素可部分解除H2O2诱导的p47phox的磷酸化活化。
　　 结论：
　　 1、槲皮素抑制H2O2诱导的VSMC过氧化物的生成。
　　 2、槲皮素对SOD活性具有保护作用。
　　 3、槲皮素通过抑制p47phox蛋白表达和磷酸化活化而减少O2·-的生成。
　　 4、槲皮素可通过多途径、多层面提高VSMC抗氧化能力。

目录

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结论

参考文献

综述 NAD(P)H氧化酶在PTCA术后血管重塑中的作用

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