大鼠脂肪间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞的实验研究

摘要

目的：随着经济的发展缺血性心脏病的患病率和死亡率也逐年提高，在一些较为发达的地区居民死亡的首位原因。缺血性心脏病的基本病理学改变在于局部心肌组织的血管狭窄闭塞，导致该处血液灌注减少甚至丧失在。常规治疗方法如经皮动脉腔内介入治疗和旁路移植术均只能解决内径>2mm的血管的病变，而对内径<2mm的血管和弥漫性病变及在无流出道而无法进行旁路手术的情况基本无能为力。并且经皮动脉腔内介入治疗和旁路移植术等目前治疗缺血性心肌病的重要手段，均可促进血管内皮细胞（endothelial cells， ECs）的凋亡和损伤引起ECs功能失调和（或）结构损害，促使血管受损后内膜增生性病变的形成和血管再狭窄的发生。
　　 随着干细胞研究和细胞移植技术的发展，细胞移植疗法有望成为治疗心血管疾病的新策略。目前，脐带血和骨髓是出生后内皮祖细胞的主要来源。和骨髓一样，脂肪组织中也存在容易获取的间质细胞，脂肪组织由中胚层发育而来，研究表明中胚层的一些诱导因子参与胚体发育和造血分化[4-5]。胚胎干细胞体外分化研究也表明中胚层细胞在内皮细胞发育过程中起重要作用[6]。
　　 2001年以来，国内外多名科研人员陆续发现，在脂肪组织中分离得到的基质血管成分（stromalvascular fraction，SVF）中，存在着一些与骨髓MSCs相似的具有多向分化能力的干细胞，分别命名为脂肪提取细胞（processed lipoaspirate cells，PLA细胞）[7-8]，基质血管成分细胞（stromal-vascular fraction cells，SVF）[9]，脂肪组织源性基质细胞（adipo-setissue deftved stromal cells，ATSCs）[10]，脂肪源性中胚层干细胞（adipose-derived mesodermal stem cell，ADMSCs）[11]，或者脂肪源性间充质干细胞（fat-deftved mesenchymal stem cells， FDMSCs）[12]。因为它们均表现出可在体外大量扩增和多向分化的能力，根据国内外研究结果，将其统称为脂肪间充质干细胞（adipose mesenchymal stem cells，AMSCs）。
　　 本试验旨在研究体外定向诱导大鼠脂肪间充质干细胞（AMSCs）向血管内皮细胞（VECs）分化的潜能与条件，为临床心血管疾病的细胞疗法和血管组织工程学的研究及应用提供实验依据。
　　 方法：
　　 实验于2007年9月至2008年12月于河北医科大学病理科实验室完成。
　　 1.大鼠脂肪间充质干细胞的分离，培养及体外诱导
　　 采用密度梯度离心法从Wistar雄性3周龄大鼠脂肪组织中分离脂肪间充质干细胞并在DMEM/F12完全培养液中进行培养。观察其细胞形态及生长特性。在细胞生长至瓶底90％融合时用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA1：1消化，充分吹打形成单细胞悬浊液，按1：3比例传代培养。选取生长良好的第三代细胞，以血管内皮细胞生长因子（vEGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）诱导其分化。其余细胞继续在DMEM/F12完全培养液中培养相同天数作为：RT-PCR及免疫细胞化学的对照组。
　　 2.诱后细胞的分化鉴定
　　 观察诱导后细胞的形态及生长特性，并应用反转录-多聚酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学（immunocytochemical，ICC）检测血管内皮细胞标志。研究AMSCs体外内皮化的潜能与条件。
　　 结果：
　　 1.大鼠脂肪间充质干细胞的分离，培养及体外诱导
　　 （1）应用密度梯度离心法分离的AMSCs纯度较高，体外培养的均一性较好。
　　 （2）原代细胞接种后4h开始贴壁，其培养无需刺激因子。原代和传代细胞生长迅速，成漩涡样生长。
　　 （3）传代细胞变成圆形，传代接种后6-8小时贴壁，而后逐渐伸展开，形态主要为梭形。
　　 （4） VEGF（50ng/ml）加IGF-1（20ng/ml）为诱导AMSCs向血管内皮细胞分化比较合适的浓度。
　　 2.诱后细胞的分化鉴定
　　 （1） RT-PCR显示AMSCs诱导前CD31表达为阴性，诱导后阳性表达。
　　 （2）免疫细胞化学显示AMSCs诱导前Ⅷ因子表达为阴性，诱导后部分细胞呈强阳性表达，部分弱阳性。阳性表达率为（62.22±3.59）％，与正常对照组相比Ⅷ因子相关抗原蛋白表达增强（P<0.05）。
　　 结论：
　　 1.密度梯度离心法是一种简单，有效分离AMSCs的方法。
　　 2.VEGF（50ng/ml）加IGF-1（20ng/ml）为诱导AMSCs向血管内皮细胞分化比较合适的浓度。
　　 3.体外培养的AMSCs具有向血管内皮细胞分化的潜能，可以用于血管新生的细胞治疗。
　　 综上所述，本实验从大鼠脂肪间充质干细胞的分离，培养，体外诱导及诱导后的分化方面进行了研究，结果显示体外培养的AMSCs具有向血管内皮细胞分化的潜能，是临床细胞移植治疗心血管疾病一个值得关注的的新观点。但本实验仅就在对AMSCs在体外诱导分化为血管内皮细胞进行了初步探讨，还需要借助实验动物模型对其进行深入的研究和探讨。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分 大鼠脂肪间充质干细胞的分离，培养及体外诱导

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 诱导后细胞的分化鉴定

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 脂肪间充质干细胞的研究进展

致谢

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