血红素加氧酶/一氧化碳系统在复发缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用及机制

摘要

目的：多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种以中枢神经系统（central nervous system，CNS）白质脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病。其确切病因及发病机制目前尚未阐明，较公认的观点认为MS与环境、遗传、感染因素有关。因此通过建立动物模型，探讨MS的发病机制，寻求有效的治疗方案，是目前研究的主要方向。
　　 越来越多的证据表明，氧化应激在MS的动物模型.实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的中起重要作用。氧化应激是多种不同疾病发病的根本机制，与许多神经疾病有关。氧化损伤在EAE中非常重要，因为中枢神经系统，尤其是少突胶质细胞，对氧化损伤非常敏感。机体中存在大量的内源性抗氧化系统以对抗氧化应激损伤。血红素加氧酶（heme oxygenase，HO）就是其中之一。HO-1是一种氧化应激诱导下的热休克蛋白，可以催化血红素分解生成一氧化碳（carbon monoxide，CO）和抗氧化剂胆绿素，后者是多种疾病情况下抗自由基的主要防御机制。HO-1可以被热休克和氧化应激等多种刺激因素诱导，在多种病理条件下发挥其抗自由基的内源性保护机制，如炎症、缺血性发作和多种神经变性疾病。但是，只有很少的研究报道过HO-1在EAE中的表达，而且其在EAE中的作用也不清楚。
　　 本实验旨在检测HO-1在EAE中的诱导表达，探讨HO-1/CO系统在EAE发病中的影响。通过抗氧化剂-硫辛酸和血红素氧合酶抑制剂-锡原卟啉对EAE大鼠的干预来观察其对脱髓鞘疾病的治疗作用，同时通过基因芯片技术检测与发病相关的基因。
　　 方法：
　　 1.动物分组：将100只成年健康雌性Wistar大鼠，体重180～200 g，随机分出正常对照组6只，其余动物用新鲜豚鼠全脊髓匀浆（GPSCH）诱导免疫，待动物第一次发病后随机选出发病组大鼠6只，其余平均分为EAE组、地塞米松组（DXM组，2 mg·kg-1·d-1）、硫辛酸组（LA组，100 mg·kg-1·d-1）、锡原卟啉组（SNPP组，loo μ mol·kg-1·d-1）。其中EAE和各药物干预组再按病程分为缓解、复发两个亚组，每亚组6只（药物干预组动物无复发者，按预实验中统计的EAE组动物缓解复发平均天数分为干预后7天组和干预后14天组）。
　　 2.模型制备：将新鲜豚鼠全脊髓制成匀浆，加上完全福氏佐剂（complete Freund's adjuvant，CFA），佐剂中所含卡介苗6mg/ml，经过乳化后按0.5 ml/只分别于大鼠四肢足垫和背部皮下注射。药物治疗组于动物发病后（神经功能评分达2分）第一天起给予相应剂量腹腔注射，连续注射7天。
　　 3.神经功能评分：于免疫诱导当日及免疫后每天对动物的体重变化、精神状态、活动情况进行观察，并对动物进行神经功能评分，采用国际通用的Kono评分标准，分为5分：0分正常；1 分动物尾部无力；2 分尾部无力+肢体无力；3 分肢体轻度麻痹；4 分肢体严重麻痹，被动翻身后不能复原；5.分濒死状态或死亡。
　　 4.组织病理学：在动物麻醉状态下，快速取其脊髓中腰膨大处组织，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，组织切片，HE染色，光学显微镜下观察炎症细胞浸润情况。
　　 5.免疫组织化学染色：取动物脊髓腰膨大处组织，石蜡包埋，做6 μ m横截面切片，血清封闭，加HO-1一抗，经二抗、三抗孵育，DAB显色，苏木精复染，脱水透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察HO-1表达情况。
　　 6.脊髓组织中cGMP的测定：动物麻醉状态下，迅速取脊髓腰膨大处组织研磨匀浆，离心，收集上清液，60℃烤箱中烘干，残渣存放于4℃冰箱中批量测定。采用放射免疫法检测cGMP含量。
　　 7.血清中MDA、SOD的测定：动物麻醉状态下，快速心脏穿刺取血2-3ml离心分离血清，标本置于-20℃冰箱内批量测定。MDA用硫代巴比妥酸法，SOD用黄嘌呤氧化法测定。
　　 8.信号转导通路发现者基因芯片检测：取各组大鼠的脊髓腰膨大处新鲜组织，提取RNA，逆转录反应生成cDNA，标记探针，与芯片杂交，加入链亲和素耦联的碱性磷酸酶（AP）及化学发光底物反应。图像采集，数据分析。
　　 结果：
　　 1.动物复发情况观察：EAE组动物复发率66.7％，LA组动物复发率33.3％，DXM组和SNPP组动物均无复发。DXM组、LA组、SNPP组复发率均小于EAE组，有统计学意义（P<0.05）。LA组与DXM组、SNPP组之间无统计学意义（P>0.05）。
　　 2.动物行为学观察：在动物缓解期（发病后第7天）和复发期（发病后第14天）时神经功能评分比较：（1） 缓解期：DXM组、LA组、SNPP组评分均小于EAE组，有统计学意义（P<0.05），DXM组、LA组和SNPP组之间评分比较无统计学意义； （2） 复发期：LA组与EAE组评分比较无统计学意义（P>0.05），DXM组和SNPP组动物均无复发。
　　 3.组织病理学观察：发病后各组大鼠脊髓组织内遍布“袖套样”炎性细胞浸润，以灰白质交界区较多，浸润细胞以淋巴细胞为主，且炎性细胞数目的多少与疾病严重程度相一致，发病期血管“袖套”数最多，缓解期血管“袖套”数减少，细胞浸润减轻，复发期几乎很少见到血管袖套样结构，但炎细胞浸润仍很多，呈弥漫分布。缓解期DXM组、LA组、SNPP组血管袖套数目均明显低于EAE组（P<0.01），但各药物干预组间无统计学意义（P>0.05）。复发期各组间血管袖套数目比较都没有统计学意义（P>0.05）。
　　 4.脊髓HO-1表达：脊髓切片免疫组化染色结果显示，发病期阳性细胞数目最多，缓解期减少，复发期阳性细胞再次增多，并主要分布在炎性细胞浸润的血管“袖套样”病变处，与病灶分布基本一致。SNPP组与DXM组、LA组、EAE组比较，同病期阳性细胞数减少，有统计学意义（P<0.05）。DXM组、LA组、EAE组三组之间无统计学意义（P>0.05）。
　　 5.脊髓组织cGMP含量比较：动物发病期cGMP含量增加，EAE组缓解期和复发期无明显下降，而同病期的地塞米松和硫辛酸干预组cGMP含量均下降。
　　 6.血清中丙二醛（MDA）含量比较：动物发病期MDA含量增加，缓解期减少，复发期再次升高，有统计学意义（P<0.05）。各药物干预组与同病期EAE组比较MDA含量均减少，但无统计学意义（P>0.05）。
　　 7.血清中超氧化物歧化酶（SOD）含量比较：动物发病期SOD含量增加，缓解期减少均有统计学意义（P<0.05），复发期无明显变化。缓解期：LA组和SNPP组含量与EAE组相比均升高，SNPP组更为显著（P<0.01），DXM组与EAE组比较无明显变化；复发期：DXM组和LA组含量与EAE组相比均升高，SNPP组反而降低。
　　 8.基因芯片分析结果：筛选出10项基因在比较中随病程变化呈现出发病期表达上调，缓解期表达下调，复发期表达再次上调的趋势，考虑与EAE发病有关。其中8项基因在DXM组中缓解期表达下调后复发期未再次上调，考虑与DXM作用有关；3 项基因在LA组中缓解期表达下调后复发期未再次上调，考虑与LA作用有关；5项基因在SNPP组中缓解期表达下调后复发期未再次上调，考虑与SNPP作用有关。
　　 结论：
　　 1.硫辛酸和锡原卟啉均可以促进EAE大鼠的病情缓解，降低动物复发率，尤其锡原卟啉与地塞米松效果相似。
　　 2.锡原卟啉可以减少EAE大鼠脊髓组织HO-1的表达。
　　 3.EAE大鼠血清中MDA、SOD含量，脊髓中cGMP含量，脊髓中HO-1表达均与病情活动性相关，随病程发展呈一定的变化趋势，药物干预对各指标有一定影响。
　　 4.EAE大鼠不同发病阶段基因表达有差异，且随病程发展呈一定趋势变化，这些差异基因与多条信号转导通路有关，某些基因表达受药物干预影响，可能与药物作用通路有关。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 复发缓解型EAE大鼠发病中的HO／CO系统的动态变化及抗氧化剂的治疗作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分复发缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠发病中信号转导通路的基因芯片研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

综述血红素加氧酶／一氧化碳系统及其与多发性硬化的关系

致谢

个人简历