p38MAPK信号转导通路在EGF诱导食管腺癌细胞表达VEGF中的作用

摘要

食管腺癌（Esophageal Adenocarcinoma，EAC）发生率的增长速度居各种癌肿的第二位，目前认为Barrett食管（Barrett's Esophagus，BE）是食管腺癌的一种癌前病变，近年来的研究表明，BE的发病率呈逐年增加的趋势，并且由BE转化而来的食管腺癌的发病率也明显增加，亚洲国家的BE和食管腺癌虽不如西方国家常见，但近年来的流行病学资料显示也呈增加的趋势，食管腺癌早期即可发生淋巴和远处器官的转移，血管的形成是促进肿瘤发生转移和为肿瘤的进一步生长提供营养所必须的，但是在食管腺癌的发生发展中，新生血管形成的机制目前还不是十分清楚。
　　 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血小板源性生长因子（PDGF）家庭的一个成员，是肿瘤诱导产生新生血管的最主要的细胞因子，是目前已知的最强的促进血管生成的因子，VEGF在肿瘤组织中特异的作用于血管内皮细胞，促进细胞的有丝分裂和增殖，从而促进瘤体血管的新生，并加速肿瘤生长，提高血管通透性，使肿瘤细胞更易于侵入和穿透血管，实现肿瘤的浸润和转移。在食管腺癌的生长和转移过程中，VEGF在调节血管生成中起重要作用。食管腺癌中VEGF是高表达的，但VEGF是如何被激活的及激活的机制目前未见有关报道。
　　 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）是细胞外各种信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者。目前认为，MAPK信号转导通路在细胞增殖、分化、凋亡、血管发生及肿瘤转移中发挥着重要作用，其成员p38MAPK是一种重要的细胞内信号转导通路。越来越多的研究表明，VEGF在许多恶性肿瘤例如肝癌、食管鳞癌等中的表达与p38MAPK信号转导通路有关。
　　 表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）不仅能够促进细胞增殖和抑制细胞凋亡，在组织损伤修复和肿瘤形成中发挥重要作用，而且还能诱导肿瘤细胞发生迁移，与肿瘤浸润和转移密切相关。表皮生长因子能与细胞膜上表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）结合使其磷酸化，再经MAPK信号通路将信号传递至核内，促进或抑制特定靶基因的表达，调节细胞的黏附和运动。有研究表明，在多种肿瘤如食管癌、胃癌、肝细胞癌、大肠癌等中EGF和VEGF均高表达，并且两者的表达呈正相关；体外培养的多种细胞系中，EGF可通过上调VEGF的表达而促进肿瘤血管生成。在食管腺癌的发生发展中，是否有EGF通过激活p38MAPK信号转导通路以致激活VEGF而导致肿瘤发生转移的相关资料未见报道。
　　 本研究从EGF着手，通过对p38MAPK信号转导通路的特异性阻断，研究p38MAPK信号转导通路在EGF诱导食管腺癌（SEG-1）细胞表达VEGF中的作用，探讨食管腺癌细胞转移中血管形成的机制。
　　 目的：通过研究p38MAPK信号转导通路在EGF诱导食管腺癌（SEG-1）细胞表达VEGF中的作用，探讨食管腺癌细胞转移中血管形成的机制。
　　 方法：采用体外细胞培养技术培养食管腺癌（SEG-1）细胞，以相同浓度EGF（100ng/ml）按不同的时间梯度刺激细胞，应用RT-PCR方法检测VEGF mRNA，Western blot法测定各时间点总p38MAPK、磷酸化p38MAPK、VEGF蛋白表达情况。并用p38MAPK特异抑制剂SB203580预处理细胞后，观察上述指标变化。
　　 结果：
　　 1 EGF对SEG-1细胞p38MAPK蛋白表达的影响：Western blot结果显示，大约在43KD位置出现p38MAPK特异性条带。EGF作用于SEG-1细胞后p38MAPK磷酸化程度有所升高，且p38MAPK磷酸化程度随EGF作用时间的变化而变化，1h、6h、12h、24h、48h的p38MAPK磷酸化的百分比分别为13.1％、31.2％、40.7％、53.5％、42.3％，可见24h的p38MAPK磷酸化水平最高，因此，认为该时间点为p38MAPK最大磷酸化时间点。
　　 2 EGF对SEG-1细胞VEGF mRNA和蛋白表达的影响：RT-PCR检测VEGF mRNA结果显示：SEG-1细胞中有VEGF基因表达，并且随着EGF作用时间的延长，VEGFmRNA的表达水平逐渐上升，EGF作用于SEG-1细胞6h、12h、24h、48h后，VEGF mRNA表达分别为：0.494±0.034、0.728±0.067、0.948±0.046、0.806±0.059，与正常对照组（0.357±0.011）相比，VEGF mRNA表达升高，有统计学意义（P<0.05）。VEGF mRNA表达明显升高后逐渐下降，于24h达高峰。Western blot检测VEGF蛋白结果显示：EGF刺激前SEG-1细胞VEGF蛋白表达量较低，刺激后1h开始上升，持续至24h达最高，呈明显的时间依赖性。EGF作用于SEG-1细胞1h后，VEGF蛋白表达为0.431±0.031，与正常对照组（0.390±0.028）相比，无统计学意义（p>0.05）。EGF作用于SEG-1细胞6h、12h、24h、48h后，VEGF蛋白表达分别为：0.484±0.042、0.794±0.031、1.000±0.024、0.869±0.023，与正常对照组相比，有统计学意义（p<0.05）。
　　 3 p38MAPK特异抑制剂SB203580处理SEG-1细胞：20μmol/L的SB203580可明显抑制EGF诱导的p38MAPK激酶活力。SB203580对EGF诱导的SEG-1细胞内VEGFmRNA和蛋白的表达亦有明显的抑制作用，而且随着SB203580浓度的升高，抑制作用更加明显，呈明显的浓度依赖性。
　　 结论：
　　 1 EGF可以引起p38MAPK磷酸化，在相同浓度EGF（100ng/ml）作用下，p38MAPK的磷酸化呈时间依赖性，最大磷酸化作用时间点为24h。
　　 2 相同浓度EGF（100ng/ml）可以明显增强SEG-1细胞VEGF mRNA和蛋白的表达，呈时间依赖性，其表达于24h达高峰。
　　 3 用p38MAPK特异抑制剂SB203580阻断p38MAPK信号转导通路后，EGF对食管腺癌（SEG-1）细胞VEGF的诱导作用受到显著抑制，并且呈浓度依赖性，本研究结果提示EGF激活VEGF增强食管腺癌肿瘤细胞转移中血管形成部分是通过p38MAPK信号传导通路实现的。

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结论

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综述 血管内皮生长因子与食管癌的研究进展

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