戊四氮点燃癫痫大鼠海马p53的表达变化

摘要

目的：癫痫是以脑部神经元过度放电所致的突然反复发作和暂时性的中枢神经系统功能失常为特征的一种常见的临床综合征。癫痫发作后脑组织内各种酶、神经递质、氨基酸等化学物质水平迅速变化，可致脑损伤，并与凋亡相关基因共同作用促使神经细胞凋亡，但目前对癫痫后细胞凋亡的分子机制尚不清楚。p53基因是一种重要的抑癌基因，近年来发现，p53基因与细胞凋亡有密切关系。本研究通过腹腔注射戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）建立癫痫持续状态大鼠模型（status epilepticus，SE），采用免疫组织化学、反转录多聚酶链反应（RT-PCR）以及Western Blot方法来检测癫痫发作大鼠脑海马神经细胞不同时间的p53表达变化，探讨凋亡相关基因P53在癫痫发病中的调控机制，为进一步研究癫痫发病后的凋亡机制奠定基础。
　　 方法：选取清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠120只，实验起始质量200±20g，12h光亮/黑暗条件、22℃～25℃环境温度，分笼喂养。随机分为癫痫持续状态组（status epilepticus，SE组）100只，再分为致痫后1、6、24、48、72小时五个亚组，每组20只，正常对照组（normal control group，NC组）20只。SE组大鼠应用生理盐水溶解的1％PTZ溶液，首先按40mg/kg腹腔注射，10min后20mg/kg腹腔注射，之后每10min腹腔注射10mg/kg，依据Racine分级标准，0级：无任何反应；Ⅰ级：胡须动、面肌抽动；Ⅱ级：点头、咀嚼或湿狗样抖动（wet dog shakes，WDS）；Ⅲ级：一侧前肢抬起、阵挛；Ⅳ级：站立伴有双侧前肢阵挛；Ⅴ级：跌倒、全身强直阵挛性发作，SE大鼠模型成功标准：运动惊厥达Ⅳ级或以上为诱发成功，且反复发作达30min以上。NC组大鼠在相同时间给予同等容量、同等次数的生理盐水。行为学观察后，各组大鼠均选取12只运用反转录多聚酶链反应（RT-PCR）方法和Western Blot方法分别测定大鼠海马p53 mRNA和蛋白的水平变化，免疫组织化学方法观察p53在海马CA1区、CA3区的表达情况。
　　 结果：
　　 1.行为学观察。SE组大鼠共100只，其中16只腹腔注射PTZ 40mg/kg，54只注射60mg/kg，25只注射70mg/kg，5只注射80mg/kg。开始发作后，首先出现点头运动、尾巴翘起，继而节律性缩头、双侧前肢抬起、肌阵挛，随着PTZ每10min注射一次，最终发展为全身强直-阵挛性发作，四肢强烈抽搐，伴有跌倒、翻滚及流涎，达到RacineⅣ～Ⅴ级的点燃标准，每次发作数分钟不等，且反复发作，持续在30min以上，达到癫痫持续状态标准。其中有34只大鼠因发作抽搐过强、时间持续长而死亡，死亡率为34％，NC组大鼠均未出现癫痫发作。
　　 2.大鼠海马组织p53 mRNA的表达。SE后6h，p53mRNA表达开始增高（P<0.01），24h达高峰（P<0.001），48h表达略有下降（P<0.05），72h后下降明显（P<0.01），但仍高于对照组。
　　 3.大鼠海马组织p53蛋白的表达。注射戊四氮大鼠出现SE后6h，海马p53蛋白表达开始增加（P<0.05），与对照组相比两SE后24h海马p53蛋白表达达高峰（P<0.001），48h蛋白表达略下降（P<0.01）。大鼠海马p53蛋白表达变化与p53 mRNA相吻合。
　　 4.p53蛋白免疫组化表达的结果。注射戊四氮大鼠出现SE后6h，海马p53蛋白表达开始增加，海马CA1区有微弱表达（P<0.05），24h后海马p53蛋白表达达高峰（P<0.001），海马CA1、CA3区均可见明显表达。p53蛋白阳性细胞主要分布在海马锥体细胞核，呈棕褐色。在NC组大鼠海马锥体细胞核未见明显p53蛋白免疫反应阳性细胞。
　　 结论：
　　 1.腹腔注射戊四氮可成功诱导大鼠癫痫持续状态模型，是模拟全身强直一阵挛性癫痫发作的一种理想模型。
　　 2.戊四氮诱导癫痫持续状态后，大鼠海马p53mRNA及其蛋白的表达于6h开始增高，24h达高峰，随后逐渐下降，表明p53基因及其编码蛋白可能是戊四氮致痫后海马神经元凋亡的重要效应因子。

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综述 P53基因与癫痫的研究进展

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