二黄糖肾康对糖尿病肾病大鼠肾脏细胞凋亡及PI3K/AKT信号转导系统的影响

摘要

目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(dia-betesreellitus,DM)代谢异常引起的肾小球硬化症,是DM常见的严重慢性微血管并发症,最终发展为肾衰竭。DN引发的终末期肾功能衰竭(ESRD)正在成为威胁糖尿病患者生命的主要因为。据美国2000年统计,每年新增ESRD患者中由DN引发的已近50％[2]。近几年在我国经济较发达地区统计资料也发现DN所致ESRD的比例达15％[2],因此,有效控制DN的发病率和疾病的进展是当前医学界重要的课题。现代医学在控制血糖、血压等基础治疗方面取得了很大的进展,但在肾病治疗方面尚无特殊进展。
　　 DN的基本病理特征早期表现为肾小球高滤过、肾小球肥大,晚期表现为肾小球系膜区细胞外基质(ECM)增生、肾小管间质纤维化,最终导致肾小球硬化、肾功能衰竭。近些年来,随着分子生物学技术的不断进步,细胞凋亡(apoptosis,APO)研究的深入,证实细胞凋亡参与了多种肾脏疾病的发生、发展及修复过程。尤其在糖尿病肾病晚期,肾小球的细胞凋亡与肾功能恶化密切相关。在细胞凋亡过程中最关键的途径是由caspase家族激活而引导的细胞凋亡。其中caspase-3和caspase-9是该家族中最重要的两个成员。Caspase-3是细胞凋亡过程中的执行分子,可以剪切细胞凋亡过程中的许多关键蛋白；而caspase-9现被证明是凋亡过程中重要的启动因子。
　　 中西医结合学院肾病研究室依据中医“脾气散精”、“肾主封藏”和“久病入络”的理论,采用益气扶正、补脾益肾、活血通络、解毒降浊的二黄糖肾康(黄芪、大黄、党参、茯苓、水蛭、鬼箭羽、桑寄生等)治疗本病,取得了较好的疗效。本实验采用切除右侧肾脏加腹腔注射链尿佐菌素(STZ)的方法复制DN大鼠模型,观察二黄糖肾康对肾脏细胞凋亡率,调控蛋白caspase-3、caspase-9的蛋白表达,及对PI3 K/AKT信号转导系统的影响。探讨二黄糖肾康对糖尿病肾病的作用机制为临床治疗DN提供科学的实验依据。
　　 方法:选用清洁级雄性健康SD大鼠60只,随机抽10只为假手术组(sham-operation group,SO),其余50只行右肾切除术,2周后伤口愈合,按50mg·kg腹腔注射链尿佐菌素(STZ),48h后尾尖取血,测定血糖。血糖≥16.7mmol·L为成模。将成模大鼠随机分为:模型组(model group,M)、二黄糖肾康高剂量组(high-dose Yushenheji group,H)、二黄糖肾康低剂量组(Low-dose Yushenheji group,L)、贝那普利组(Benazepril group,B),每组10只。EL组、EH组和B组均于上午给予糖适平5mg/kg体重。下午B组给予贝那普利1.7mg/kg体重；EL组给予二黄糖肾康口服液0.5mL/100g体重(相当于成人的10倍)；EH组给予二黄糖肾康1mL/100g体重(相当于成人的20倍)。本实验共8周,实验期间动物自由进食、饮水,不使用胰岛素及其他降糖药物。第8周最后一次给药后,禁食8小时,断头处死,无菌操作取左肾,去掉肾脏包膜,取部分皮质置于70％酒精中固定,用于流式细胞术检测；将剩余部分的肾皮质置于液氮中冻存后转至-70℃存放,以备用检测Westernblot,测定信号蛋白的表达。
　　 结果:
　　 1二黄糖肾康对DN大鼠KW/BW的影响
　　 M组(6.81±0.51)高于SO组(3.36±0.68),两组比较有显著性差异(p<0.01)。各治疗组与M组相比明显下降(p<0.05,p<0.01),有显著差异。B组(4.80±0.83)同H组(4.67±0.70)比较无显著性差异(p>0.05)；H组明显低于L组(6.17±0.55),两组比较有显著性差异(p<0.01)。
　　 2二黄糖肾康对肾脏细胞凋亡率的影响
　　 SO组(4.17±0.77)；H组(5.24±0.44)比B组(7.58±1.08)明显减少(p<0.05)；H组与L(6.34±0.95)组比较,有减少趋势,但无统计学意义(p>0.05)。各治疗组比M(13.98±1.74)组均明显减少(p<0.01)；
　　 3二黄糖肾康对肾脏细胞caspase-9、caspase-3蛋白表达的影响
　　 各治疗组与M组caspase-9(1.35±0.02)、caspase-3(1.38±0.01)比较发现EL组caspase-9(1.22±0.02)、caspase-3(1.28±0.01)；EH组caspase-9(1.08±0.01)、caspase-3(1.10±0.01)；B组caspase-9(1.31±0.01)、caspase-3(1.34±0.02),均有明显差异(p<0.01或P<0.05)。EL组、EH组与B组比较,亦有明显差异(p<0.05,P<0.01)；EL组与EH组相比,有明显差异(p<0.01)。
　　 4二黄糖肾康对肾脏细胞信号蛋白表达的影响
　　 利用图片扫描仪分析结果显示,各组Akt的表达水平无显著差异。B组、EL组、EH组在P—Akt表达水平上与M组sham相比明显升高(p<0.01)。EH组在P-Akt表达水平上与EL组B相比明显升高。
　　 结论:
　　 1二黄糖肾康汤能显著减少肾脏细胞凋亡率。
　　 2二黄糖肾康汤能下调caspase-9、caspase-3的蛋白表达,激活PI3 K/AKT信号通路,来延缓糖尿病肾病的发生与发展。

目录

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结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 中医药治疗糖尿病肾病的进展

参考文献

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