雌、孕激素受体在子宫内膜样腺癌中的表达及疏肝益肾方对其体内外抑瘤作用的研究

摘要

子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)是常见女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,约占女性生殖道恶性肿瘤20％～30％。我国学者对中药治疗子宫内膜癌的作用机制进行了多年探索,取得了一定进展。子宫内膜癌相当于中医的瘾瘕、肠蕈等范畴,中医认为子宫内膜癌的病机之一为肝肾不足,冲任失调,肾为元气之根,冲任之本。肾气充盛则冲任脉盛,冲为血海,任主胞胎,冲任之脉系于肝肾,肝肾不足,无以充养冲任,肝肾不足,冲任失调,气血运行不畅,经络阻塞而成该病,疏肝益肾方是治疗子宫内膜癌主要方法之一。它是以近代名医张锡纯所创理中汤为基本方加减所得,其主要成分为:黄芪、白术、三棱、莪术、青皮、陈皮、女贞子、枸杞子、炮山甲、甘草等。临床应用证实其治疗晚期子宫内膜癌,能够延长患者生存期,改善症状,是从多途径、多角度、多层次发挥治疗作用的,其具体机制不甚明了。虽然国家已经制定了一些常见疾病证候评价标准,但是专门针对子宫内膜癌证候评价的标准尚属空白。随着分子生物学技术的发展及中医理论现代化的进展,中医学已逐步从临床经验总结过渡为基础实验研究,步入了实验医学的新时代。建立体现中医特点的症状评估方法,以及有程度变化的量化指标,是中医辨证、疗效判定需要解决的问题。
　　 本课题从三方面进行了研究:(1)通过对比观察绝经前后子宫内膜样腺癌及正常子宫内膜雌激素受体亚型Erα、Erβ和PR的蛋白及分子水平表达情况,并结合患者的临床病理资料进行综合分析,探讨它们在子宫内膜样腺癌发生发展中的作用,为临床治疗提供理论支持。(2)利用体外培养人子宫内膜癌Ishikawa细胞,采用Real-time PCR扩增技术、Western-blot杂交技术及MTT方法,观察中药疏肝益肾方作用后的Ishikawa细胞生长情况及Erα,Erβ的表达变化。(3)观察中药疏肝益肾方联合顺铂对人子宫内膜腺癌小鼠移植瘤体内生长情况的影响及作用机理。
　　 本研究共分为三部分:
　　 第一部分雌激素受体亚型、孕激素受体在子宫内膜样腺癌中的表达及意义
　　 目的:通过对比观察绝经前后子宫内膜样腺癌及正常子宫内膜雌激素受体亚型Erα、Erβ和PR的蛋白及分子水平表达情况,结合临床病理资料进行综合分析,探讨雌、孕激素受体在子宫内膜样腺癌发生发展中的作用,使我们对子宫内膜样腺癌的发生发展机制有新的认识,为临床治疗提供理论支持。
　　 方法:选取2006-2009年河北医科大学第二医院经病理证实的40例绝经前后子宫内膜样腺癌组织(绝经前13例,患者年龄33～42岁,平均39岁,绝经后27例,患者年龄48～69岁,平均56.5岁,均为自然绝经1年以上),术前未经化疗、放疗及内分泌治疗,临床分期按1988年国际妇产科联盟(FIGO)手术-病理标准,Β期23例,占57.5％,Ⅱ期9例,占22.5％,Ⅲ期6例,占15.O％,Ⅳ期2例,占5.0％。组织病理分级:高分化11例,占27.5％,中分化20例,占50.0％,低分化9例,占22.5％。正常对照组取自同期因子宫脱垂行手术及生殖道畸形整形妇女正常子宫内膜30例(绝经前对照组14例,绝经后对照组16例),排除内科疾病,术后病理证实为正常子宫内膜。应用免疫组化SP法和半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定蛋白及mRNA的表达,分析比较子宫内膜样腺癌与正常子宫内膜绝经前后Erα、Erβ和PR表达情况的差异。
　　 结论:(1)Erα是子宫内膜样腺癌的优势受体,在本病发生中起促进作用;Erβ和PR在子宫内膜样腺癌发生中可能起到一定的抑制作用;(2)在期别晚、分化差的子宫内膜样腺癌中Erα、Erβ和PR均呈低表达状态,说明Erα在子宫内膜样腺癌的发展中出现改变,可能仅在该病初期起促进作用;Erβ和PR持续呈低表达,可能造成了本病发展;Erα、Erβ和PR均低表达提示疾病预后差。(3)临床有望从提高Erβ及PR的含量为突破口,找到既能扭转本病预后又可改善低雌激素症状的药物,为临床进行内分泌治疗提供理论基础。
　　 第二部分疏肝益肾方对子宫内膜癌Ishikawa细胞的作用研究
　　 目的:以顺铂为对照药,研究疏肝益肾方对子宫内膜癌Ishikawa细胞增生的抑制作用,并探讨其抑制Ishikawa细胞增生的作用机制,以期初步评价疏肝益肾方辅助治疗子宫内膜癌的可行性。
　　 方法:复苏、培养子宫内膜癌Ishikawa细胞,传代至足够细胞数量后,选取生长状态良好的Ishikawa细胞进行实验。设置正常对照组、阴性对照组(阴性血清组)、含药血清组(大鼠含疏肝益肾方剂血清组)、联合用药组(疏肝益肾方剂联合顺铂组)及阳性对照组(顺铂组),共5组。每组设6个平行孔,培养72小时后,弃细胞上清,而后每孔加入20ul MTT溶液,37℃继续培养4h,再加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min后,在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值(A值)。以对数生长期细胞105个/孔铺六孔细胞培养板,过夜培养后,将上述5组药剂分别作用于细胞,每组设6个平行孔,培养72小时后,收集细胞提取mRNA,行Real-time PCR,检测Erα和Erβ mRNA转录水平。Western blot检测以上五组细胞中Erα和Erβ蛋白的含量。数据分析:采用方差分析进行统计检验,采用SPSS14.0统计软件进行统计分析,检验水准取P＜0.05。
　　 结论:疏肝益肾方对体外Ishikawa细胞株有显著的抑制作用,并选择性降低Erα表达,而且扭转了化疗药物对Erβ的抑制作用;而疏肝益肾方剂协同顺铂对Ishikawa细胞株起到抑制作用的同时,亦能够降低Erα表达,而几乎不影响Erβ的表达;单独应用顺铂却显著降低了Ishikawa细胞株中Erα与Erβ的表达。提示疏肝益肾方剂对子宫内膜样腺癌有一定的抑制作用,但更重要的是联合使用化疗药物后既可以取得好的抑瘤效果,又能对Erα起到抑制作用,几乎不影响Erβ的表达,故该方剂联合化疗药后可以克服化疗药物对雌激素受体的抑制作用,这种选择性的对雌激素受体亚型的作用,可能是该方剂能够缓解恶性肿瘤患病妇女尤其是年轻患者低雌激素临床症状的基础。
　　 第三部分疏肝益肾方对小鼠子宫内膜癌移植瘤的影响及其机制的研究
　　 目的:本课题前期的系列研究发现,疏肝益肾方对子宫内膜样腺癌有一定的抑制作用,但更重要的是联合使用化疗药物后既可以取得好的抑瘤效果,又针对性的对Erα起到抑制作用,并且几乎不影响Erβ的表达。因而本部分将进一步在体外探讨中药疏肝益肾方剂对子宫内膜癌Ishikawa细胞的小鼠模型的抑瘤效果。
　　 方法:子宫内膜癌Ishikawa细胞于10％FBS+1640培养基中培养并传代,取生长状态良好的细胞经胰酶消化后,用计数板计数,将浓度调整至5×107个/0.2ml以供注射。取50只BABL/C小鼠,将5×107个(0.2ml)Ishikawa细胞接种于每只小鼠背部皮下,接种8d后开始抑瘤实验。将造模成功荷瘤小鼠随机分成4组,每组10只:正常对照组10只,腹腔注射生理盐水0.2ml/只,每天1次,连续15天;中药组10只,给予疏肝益肾方0.2ml/只灌胃,每天2次,连续15天;顺铂组10只,给予顺铂腹腔注射0.2ml/只,每天1次,连续15天;顺铂与疏肝益肾方联合用药组,给予疏肝益肾方0.2ml/只灌胃,每天2次,并给予顺铂腹腔注射0.2ml/只,每天1次,连续15天。观察各组小鼠的生存质量情况,每3天称取体重一次并用游标卡尺测量肿瘤长径(L)和短径(W),并按肿瘤体积计算公式V=L·W2/2计算肿瘤体积。描绘肿瘤生长曲线,称量瘤重,计算抑瘤率(IR)[肿瘤抑制率=(生理盐水组肿瘤重量-实验组肿瘤重量)/生理盐水组肿瘤重量×100％]。采用麦克奥迪数码医学图象分析系统对免疫组织化学结果行定量分析检测Erα、Erβ、PR在小鼠荷瘤标本中的表达。数据分析:采用多样本均数比较的方差分析及两两比较的LSD-t检验,数据分析采用SPSS14.0统计软件完成,以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结论:1.本研究观察到注射Ishikawa细胞数达1×107以上时可形成肿瘤,少于此量时较难或不形成肿瘤;当细胞数达5×107时肿瘤生长较快,随着加大种植细胞数量后,成瘤率明显增加。2.Erα、Erβ和PR在子宫内膜癌中有不同程度的表达,Erα和Erβ、PR的表达呈负相关,提示Erα在子宫内膜癌的发生发展过程中起着一定的促进作用,而Erβ和PR起到一定的抑制作用。3.中药作用荷瘤小鼠后,对小鼠移植瘤的生长有抑制作用,而中药联合顺铂作用荷瘤小鼠后,产生了较强的抑制作用,提示中药疏肝益肾方可能在子宫内膜癌的治疗中发挥重要作用。
　　 基于上述系列研究可得出以下结论:雌、孕激素受体与子宫内膜样腺癌关系密切,中药疏肝益肾方剂可以上调Erβ,抑制Erα的表达,虽然对此结论有不同的观点,但仍为研究中药治疗子宫内膜癌及缓解恶性肿瘤患者尤其是年轻患者低雌激素临床症状提供了新的临床思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写

引言

第一部分 雌激素受体亚型、孕激素受体在子宫内膜样腺癌中的表达及意义

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 疏肝益肾方对子宫内膜癌Ishikawa细胞的作用研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 疏肝益肾方对小鼠子宫内膜癌移植瘤的影响及机制的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一:子宫内膜癌激素治疗进展

综述二:子宫内膜癌的内分泌细胞及其内分泌分化机制的探讨

个人简历