白细胞介素27基因转染食管癌患者树突状细胞的抗肿瘤效应及其机理研究

摘要

食管癌是人类常见恶性肿瘤之一，全世界每年约30万人死于食管癌。随着免疫学和分子生物学研究的进展和对肿瘤认识的逐步深入，明确了食管癌的发生、发展与机体免疫功能低下密切相关。因此，如何激发机体抗肿瘤免疫反应，杀灭体内残余癌细胞，是防治食管癌复发转移，提高疗效的关键。由此，生物治疗已成为肿瘤治疗的一种新策略。诱导机体抗肿瘤特异性和细胞毒活性T细胞产生，达到特异性攻击肿瘤的作用是肿瘤生物治疗的本质。
　　 树突状细胞（dendriticcell，DC）是机体内功能最强的抗原提呈细胞（antigenpresentingcell，APC），能摄取、加工提呈抗原，刺激初始T细胞增殖分化，处于启动、调控并维持细胞免疫应答的中心环节，对激发抗肿瘤免疫有重要作用，在肿瘤细胞和T细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用。成熟的DC能够表达高水平的共刺激分子、黏附分子及MHC分子，可有效内化、加工和提呈可溶性抗原、肿瘤抗原，并能激发初始T细胞，启动T细胞介导的特异性抗肿瘤免疫反应。荷瘤宿主体内DC的异常是肿瘤免疫逃逸机制的一个重要方面，DC数量减少和功能低下或缺陷，不能有效提呈肿瘤抗原和提供协同刺激信号，以致T细胞介导的抗肿瘤免疫不能有效发挥作用，因此，如何增加患者体内DC数量并活化DC功能是肿瘤免疫治疗的一个重要研究方向。
　　 细胞因子是免疫调节的重要因素，可以活化免疫细胞，增强免疫细胞的功能，有的细胞因子甚至可以直接杀伤肿瘤细胞。因此，通过适当载体将细胞因子基因定向导入肿瘤细胞，使其在宿主体内持续产生细胞因子，可增强机体免疫功能，并且活化的DC进而诱导产生特异性抗肿瘤免疫反应。白细胞介素27（Interleukin，IL-27）是2002年Pflanz等发现并命名的一种新的细胞因子，由活化的树突状细胞和巨噬细胞等抗原提呈细胞产生。IL-27具有免疫调节活性，在抗肿瘤免疫过程中起重要作用。由于该因子是新近发现的细胞因子，许多作用机制尚不清楚。本研究主要目的是深入探讨IL-27转染DC后在人食管癌细胞荷瘤小鼠体内外的抗肿瘤作用及其机理，为食管癌免疫治疗研究提供实验和理论依据。
　　 第一部分食管鳞癌及其引流淋巴结组织中树突状细胞CD1a和CD83的表达及其临床意义
　　 目的：探讨肿瘤组织浸润树突状细胞（tumorinfiltratingdendriticcell，TIDC）CD1a和CD83在食管鳞状细胞癌（esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC）组织和引流淋巴结中的表达及其与ESCC临床病理特征的关系。
　　 方法：选取河北医科大学第四医院胸外科2002年5月至2003年12月间手术切除并经病理确诊的78例ESCC组织、24例正常食管黏膜、35例正常淋巴结和32例转移淋巴结组织石蜡标本，采用流式细胞术检测上述组织TIDC中CD1a和CD83表达。
　　 结果：ESCC组织中CD1a和CD83的表达水平明显低于正常食管黏膜组织（均P<0.05）。CD1a表达水平与ESCC患者的浸润深度、临床分期、分化程度及淋巴结转移无相关性（均P>0.05）；CD83表达水平与ESCC患者的临床分期及淋巴结转移有关（P<0.05）。转移淋巴结组织中CD1a表达水平与正常淋巴结组相比无显著性差异（P>0.05）；转移淋巴结组织中CD83表达水平显著低于正常淋巴结组织（P<0.05）。
　　 结论：食管鳞状细胞癌组织和引流淋巴结组织TIDC中CD83表达水平反映食管癌的局部免疫状态，成熟TIDC数量减少使DC的抗原提呈功能降低，机体对食管癌细胞识别能力减退，从而导致肿瘤免疫逃逸。本研究为阐明食管癌免疫逃逸机制和开展食管癌的免疫生物学治疗提供了理论和临床基础。
　　 第二部分食管癌患者外周血细胞诱导、培养树突状细胞的实验研究
　　 目的：探讨从食管癌患者外周血分离、诱导与扩增树突状细胞（DC）的有效方法。
　　 方法：采用密度梯度离心法从食管癌患者外周血分离单个核细胞，分别加入GM-CSF（100ng/ml）+IL-4（50ng/ml），（作为对照组）；GM-CSF（100ng/ml）+IL-4（50/ml）+flt-3L（40ng/ml），（作为实验1组）；第三组加入GM-CSF（100ng/ml）+IL-4（50ng/ml）+flt-3L（40ng/ml）+SCF（100ng/ml），（作为实验2组）。于37℃、5％CO2环境下进行培养，动态观察细胞生长情况，流式细胞仪检测培养第六天时DC表面分子CD1a、CD83、CD80、CD86的表达水平。
　　 结果：上述不同刺激物均能从外周血单个核细胞成功诱导出DC，与对照组相比，实验组诱导出更多数量的DC，其中以实验2组最多；培养至第六天时，两实验组DC细胞表型CD1a表达率与对照组无明显差别（P>0.05），CD83、CD80、CD86表达水平明显高于对照组（P<0.01），其中以实验2组表达水平最高（P<0.01）。
　　 结论：联合应用GM-CSF、IL-4、flt-3L和SCF能有效的从食管癌患者外周血诱导培养出大量具有活性的DC，为进一步的临床应用研究奠定基础。
　　 第三部分抗原致敏IL-27基因修饰的树突状细胞诱导抗食管癌免疫反应的体外实验研究
　　 目的：探讨食管癌细胞抗原致敏白介素-27（IL-27）基因修饰的树突状细胞（DC）体外诱导CTL杀伤食管癌细胞的效能及其机制。
　　 方法：采用重组逆转录病毒介导IL-27基因转染食管癌患者外周血DC；反复冻融法提取食管癌细胞裂解产物并致敏经IL-27转染的DC；用RT-PCR检测IL-27基因的表达；ELISA法检测各组DC培养上清中IL-27、IL-12、IFN-γ的水平和不同组别诱导产生的各组CTL培养上清中IFN-γ的水平；流式细胞术分析各组DC表面CD1a、CD83、CD80、CD86的表达；四甲基偶氮唑盐（MTT）实验检测各组DC刺激T细胞增殖活性和检测各组DC诱导细胞毒T细胞（CTL）杀伤食管癌细胞的效能。
　　 结果：成功建立了能分泌IL-27的DCIL-27细胞，经RT-PCR和ELISA证实该细胞在mRNA和蛋白水平均可稳定表达IL-27；经抗原致敏IL-27基因转染的DC（DCIL-27+Ag）高表达CD1a、CD83、CD80、CD86分子，表达水平分别为[（55.50±6.62）％，（82.67±7.92）％，（78.33±7.31）％和（85.33±4.32）％]，并可分泌高水平IL-12（107.85±7.20）pg/ml、IL-27（430.39±10.12）pg/ml及IFN-γ（411.97±17.80）pg/ml，可明显刺激同源T细胞增殖，增强CTL上清中IFN-γ水平（751.50±31.30）pg/ml，显著高于其它组；诱导产生CTL对食管癌细胞有强大的杀伤作用，显著高于其它组。
　　 结论：表达IL-27基因的DCIL-27+Ag细胞可增强体外诱导自体T细胞产生特异性抗食管癌免疫，其作用机制可能与IL-27基因修饰和抗原致敏活化了DC的第二信号表达，促进DC高分泌IL-27、IL-12，活化T细胞致使CTL分泌IFN-γ能力增强密切相关。
　　 第四部分抗原致敏IL-27基因修饰的树突状细胞激活特异性CTL对人食管癌裸鼠移植瘤生长的影响
　　 目的：研究食管癌细胞抗原致敏IL-27基因修饰的DC活化特异性CTL对人食管癌裸鼠移植瘤生长的影响，研究其诱导细胞凋亡的作用机制。
　　 方法：构建人食管癌细胞裸鼠移植瘤模型，共30只裸鼠随机分为5组，每组6只，分别用PBS（Ⅰ组）、初始T细胞（Ⅱ组）、DCnaive+初始T细胞（Ⅲ组）、DCIL-27+初始T细胞（Ⅳ组）和DCIL-27+Ag+初始T细胞（Ⅴ组），于肿瘤周围注射，间隔4天，共治疗5次。观察荷瘤小鼠的肿瘤体积、瘤重和抑瘤率；TUNEL法检测五组荷瘤小鼠肿瘤组织细胞的原位凋亡；流式细胞术检测移植瘤细胞的细胞周期、凋亡率及凋亡相关蛋白Fas和Caspase-3的表达。
　　 结果：免疫接种第Ⅴ组细胞治疗的荷瘤小鼠移植瘤组织的体积和重量分别为（0.56±0.07）cm3、（0.68±0.04）g，明显小于其它治疗组和对照组，差异有显著性意义（P<0.01）；抑瘤率为58.28％，明显大于其它治疗组和对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。TUNEL法检测结果显示，免疫接种第Ⅴ组细胞荷瘤小鼠的肿瘤组织内凋亡细胞灶性分布，细胞核内有棕黄色颗粒，免疫接种第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组细胞荷瘤小鼠肿瘤组织内可见少量凋亡细胞，Ⅰ组仅见极少数散在分布的凋亡细胞。接种第Ⅴ组细胞荷瘤小鼠肿瘤组织中凋亡率明显高于其余接种组（P<0.01）。FCM分析结果显示，免疫接种第Ⅴ组细胞的荷瘤小鼠皮下肿瘤组织内细胞增殖指数为（23.92±1.60）％，显著低于其余接种组，差异有显著性意义（P<0.01）；而细胞凋亡率为（32.78±0.83）％，显著高于其余接种组，差异有显著性意义（P<0.01）；Fas和Caspase-3蛋白表达水平均明显高于其余接种组（P<0.01）。
　　 结论：食管癌细胞抗原致敏IL-27基因修饰DC可活化特异性CTL，在荷瘤小鼠体内对食管癌细胞具有强大细胞毒作用，显著抑制食管癌细胞体内增殖、促进其凋亡，为DC应用于食管癌的免疫治疗提供了理论和动物实验依据。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写

引言

第一部分 食管鳞癌及其引流淋巴结组织中树突状细胞CD1a和CD83的表达及其临床意义

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 食管癌患者外周血细胞诱导、培养树突状细胞的实验研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 抗原致敏IL-27基因修饰的树突状细胞诱导抗食管癌免疫反应的体外实验研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分 抗原致敏IL-27基因修饰的树突状细胞激活特异性CTL对人食管癌裸鼠移植瘤生长的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

综述一

参考文献

综述二

参考文献

致谢

个人简历