HMGB1对小鼠系膜细胞细胞周期及细胞周期相关蛋白表达的影响

摘要

目的:本实验以小鼠系膜细胞MMC为研究对象,以重组HMGB1为刺激物,试图通过检测细胞周期的变化及细胞中PCNA,CyclinD1,CDK4和p16的表达水平,并分析它们之间的相关性,初步探讨HMGB1对系膜细胞的促增殖作用以及对细胞周期调控相关因子的影响。
　　 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种常见的由免疫复合物沉积造成多器官损伤的自身免疫性疾病,而狼疮性肾炎(Lupus nephritis,LN)在本病中发生率很高且难以治愈,是本病致死的主要原因之一。系统性红斑狼疮的发病机制仍不明朗,但通常认为,机体失去正常免疫耐受,淋巴细胞功能异常,从而引起各种细胞因子的分泌和表达紊乱可能是本病发生机制的核心。高迁移率族蛋白1(high mobility groupprotein box1,HMGB1)作为一种促炎因子,可由单核巨噬细胞,多种免疫细胞及坏死细胞主动合成和主动分泌,经与其相应受体结合,激活多种信号转导途径,从而促进炎性因子的合成及释放,并与这些炎性因子相互作用,引发及放大炎症效应;同时HMGB1还是一种免疫佐剂,它能够为免疫细胞提供损伤信号,以启动免疫效应,实现对异物的清除,从而介导免疫应答的完成。研究显示,HMGB1参与了系统性红斑狼疮,类风湿性关节炎,干燥综合征等多种免疫性疾病的发生发展过程[1]。我们前期的实验检测了HMGB1及其可能受体在狼疮性肾炎患者的外周血及狼疮小鼠模型肾组织中的表达水平,结果显示:HMGB1及其可能受体在狼疮性肾炎发病过程中呈明显的高水平表达,同时与系膜细胞增生相关,考虑HMGB1可能通过诱导系膜细胞的异常增殖促使了增生性肾小球肾炎的发生[2],但其对系膜细胞可能的作用机制目前尚缺乏深入研究,因此开展了此次试验。
　　 方法:选取小鼠系膜细胞MMC为研究对象,随机分为正常对照组及50pg/L HMGB1刺激组,分别培养4,8和12小时,收集不同时间点细胞,分别以流式细胞术检测小鼠系膜细胞的细胞周期分布;免疫细胞化学检测PCNA蛋白在小鼠系膜细胞中的表达情况;RT-PCR检测小鼠系膜细胞中CyclinD1mRNA表达的变化,Western Blot检测小鼠系膜细胞中CyclinD1,CDK4及p16蛋白的表达变化。
　　 结果:
　　 1 HMGB1刺激后不同时间点小鼠系膜细胞细胞周期分布不同
　　 与正常对照组相比,HMGB1作用至4h～8h,处于G1期的细胞所占比例逐渐减少,而处于S期细胞所占比例增高,增殖指数PI值(PI=(S期+G2M期)/(S期+G2M期+G0/G1期)×100％)明显升高,分别为(64.6±0.23)和(69.3±0.15),与正常对照组相比(57.8±0.32)差异具有统计学意义(P＜0.05);至HMGB1作用12h,PI值(57.5±0.02)与正常对照组相比,无明显差异。(P＞0.05)(Fig.1)
　　 2 HMGB1刺激早期能够上调小鼠系膜细胞中PCNA蛋白的表达
　　 正常情况下,PCNA蛋白的阳性信号以基础水平量表达于小鼠系膜细胞的细胞核内,HMGB1作用至4小时,其阳性信号仍存在于细胞核内,但表达明显增强,至作用至8小时～12小时,PCNA蛋白的阳性信号仍表达于细胞核内,表达量逐渐减弱但仍高于基础水平。(Fig.2)
　　 3 HMGB1刺激能够升高小鼠系膜细胞中CyclinD1mRNA及蛋白的表达
　　 HMGB1刺激后小鼠系膜细胞内CyclinD1 mRNA及蛋白表达趋势相同。与正常对照组(0.17±0.02,0.31±0.02)相比,给予HMGB1刺激后4小时,小鼠系膜细胞CyclinD1 mRNA及蛋白的相对表达量均明显增强(0.59±0.02,0.59±0.03),与正常对照组(0.17±0.02,0.31±0.02)相比,差异具有统计学差异(P＜0.05);HMGB1作用至8小时其表达都逐渐减弱(0.26±0.01,0.27±0.01)，到12小时基本恢复正常(0.13±0.01,0.13±0.02),与正常对照组相比,差异均无统计学差异(P＞0.05))。
　　 4 HMGB1刺激后上调小鼠系膜细胞中CDK4蛋白的表达
　　 与正常对照组相比(0.67±0.02),小鼠系膜细胞的CDK4蛋白的相对表达量在HMGB1作用4小时时呈明显增强趋势(0.88±0.03),与正常对照组相比,差异具有统计学差异(P＜0.05)。其表达量在8～12小时降至接近正常水平(0.45±0.02,0.42±0.01),与正常对照组相比,差异无统计学差异(P＞0.05)
　　 5 HMGB1刺激后能够时间依赖性的降低小鼠系膜细胞中p16蛋白的表达
　　 与正常对照组相比(1.11±0.02),HMGB1作用后4,8及12小时小鼠系膜细胞中p16蛋白的表达水平呈持续降低趋势(0.47±0.02,0.46±0.06,0.14±0.02),呈时间依赖性,与正常对照组相比,差异均具有统计学差异(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 HMGB1可能是通过上调细胞周期调控蛋白CyclinD1/CDK4的表达,并下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16的表达,促进细胞从G0/G1期进入S期,介导了小鼠系膜细胞的异常增殖,可能是HMGB1参与狼疮性肾炎发病的可能机制之一。

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结果

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附表

讨论

结论

参考文献

综述 如HMGB1的研究进展

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