异土木香内酯抑制人子宫内膜癌细胞增殖活性及作用机制探讨

摘要

目的：土木香(Inula helenium L.)系菊科旋覆花属植物，为多年生草本植物，广泛分布于欧洲、北美洲及东亚等地区。其根供药用，具有健胃、利尿、祛痰和驱虫等功效。目前已从土木香中分离得到土木香内酯、异土木香内酯(Isoalantolactone)和二氢土木香内酯等多种成分，这些成分具有抗肿瘤、抗炎、驱虫、抗菌、降血糖和镇痛等多种生物活性。本实验以人子宫内膜癌细胞株(HEC-1)为材料，研究异土木香内酯对HEC-1细胞增殖的抑制作用，并进一步探讨异土木香内酯抑制HEC-1细胞增殖的作用机制。
　　 方法：
　　 1、MTT(四甲基偶氮唑蓝)比色法
　　 1.1肿瘤细胞株悬液制备
　　 用RPMI-1640完全培养基调整HEC-1肿瘤细胞株浓度为2×105个/ml的细胞悬液备用。
　　 1.2体外抑瘤实验
　　 取对数生长期的HEC-1细胞，将细胞悬浮接种于96孔板，每孔50μL(含1×104个细胞)，分别加入溶剂对照(终浓度0.1％DMSO)、阳性对照顺铂和终浓度为100μmol/L、101μmol/L和1μmol/L的异土木香内酯各50μL，每组均设3个复孔，置于饱和湿度、37℃和5％CO2培养箱中培养48h。于培养结束前4h，各培养孔加入5mg/mL的MTT10μL。培养4h后，弃去培养上清，每孔加入反应停止液150μL，振荡10min，使结晶充分溶解，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值(OD值)，并计算细胞生存率率，细胞生存率(％)=(对照组OD值/对照组OD值)×100％。实验数据用The SPSS system V13.0软件进行处理，受试药物对细胞的浓度-效应曲线用Hill数学模型拟合，计算药物的IC50值。
　　 2、荧光素酶报告基因检测
　　 取对数生长期的HEC-1细胞，以每孔5×104个细胞接种于24孔板中，用含10％FBS的RPMI-1640培养液培养细胞24 h，去培养液，用PBS洗细胞两次。每孔加入无血清的RPMI-1640培养液0.3mL。取500ng荧光素酶报告基因质粒pG13-Luc、pGBax-Luc、IgK-Luc和NFAI-Luc以及5ng内参照基因质粒SV-40-Rluc与1.2μg脂质体共同加入0.6mL无血清的RPMI-1640培养液中，混匀室温孵育30 min后转入培养孔中，每孔25μL，于饱和湿度、37℃C和5％CO2培养箱中培养3 h。弃去转染液，更换10％FBS的RPMI-1640培养液0.9 mL，于饱和湿度、37℃和5％CO2培养箱中培养24 h。分别加入含有异土木香内酯(终浓度为5μmol/L和101μmol/L)和不含异土木香内酯的10％FBS的RPMI-1640培养液0.1mL，于饱和湿度、37℃和5％CO2培养箱中培养24 h。弃去培养液，用1×PLB(passive lysisbuffer)裂解细胞后，立即上机检测，记录报告基因pG13-Luc、pGBax-Luc、IgK-Luc和NFAT-Luc荧光素酶与内参照基因SV-40-Rluc荧光素酶活性的比值。
　　 3、Western blotting检测
　　 取对数生长期的HEC-1细胞，按2×106个细胞/培养皿接种HEC-1细胞。加入含终浓度为2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L异土木香内酯的培养基培养细胞48小时，离心收集细胞，用PBS洗涤细胞后，加入上样缓冲液100μL，剧烈震荡后冰浴下超声波处理1min。100℃加热10min使蛋白质变性，12000r/min离心10min，取上清液测定蛋白浓度。取50μg蛋白在SDS-PAGE电泳下分离，电转移至硝酸纤维膜，用5％脱脂奶粉于室温下摇动封闭膜2 h。弃封闭液，用1×TBS-T洗膜，15min×3次。膜在抗p53多克隆抗体(1:500)和抗Bax多克隆抗体(1:700)稀释液中室温过夜孵育，1×TBS-T洗膜15 min，共3次后，在二抗稀释液(抗鼠1:5000)中孵育40 min。再次洗膜后加入ECL试剂，反应1 min，用X片曝光1～10 min后，显影。
　　 4、半胱天冬酶抑制剂对异土木香内酯抑制HEC-1细胞增殖的翻转作用取对数生长期的HEC-1细胞，将细胞悬浮接种于96孔板，每孔50μL(含1×104个细胞)，分别加入含有半胱天冬酶抑制剂(终浓度为20μmol/L)的异土木香内酯(终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L)共同孵育HEC-1细胞和不含半胱天冬酶抑制剂的异土木香内酯(终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L)单独孵育HEC-1细胞，各50μL，每组均设3复孔，置于饱和湿度、37℃和5％CO2培养箱中培养48 h。于培养结束前4 h，各培养孔加入5 mg/mL的MTT10μL。培养4h后，弃去培养上清，每孔加入反应停止液150μL，振荡10min，使结晶充分溶解，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值(OD值)，并计算细胞生存率率，细胞生存率(％)=(对照组OD值/对照组OD值)×100％。
　　 结果：
　　 1、MTT(四甲基偶氮唑蓝)比色法结果
　　 本实验采用MTT法探讨了异土木香内酯对HEC-1细胞增殖活性的影响。顺铂和异土木香内酯对HEC-1细胞的增殖显示强的抑制活性，1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的顺铂和异土木香内酯处理的HEC-1细胞，其细胞生存率分别为79.16％、51.23％、24.54％和63.96％、34.67％、13.96％，并呈现较好的剂量依赖关系，与空白对照组相比具有非常显著性(P<0.01)和显著性(P<0.05)的差异，IC50分别为11.32μmol/L和4.16μmol/L。
　　 2、异土木香内酯对HEC-1细胞内pG13-Luc、pGBax-Luc、IgK-Luc和NFAT-Luc的诱导表达
　　 使用10μmol/L的异土木香内酯处理HEC-1细胞后，观察其对HEC-1细胞报告基因表达的影响，结果显示，异土木香内酯可明显诱导HEC-1细胞内pGBax-Luc的表达，对p53的报告基因PG13-Luc、与NF-κB的报告基因IgK-Luc以及与NFAT的报告基因NFAT-Luc则不显示诱导活性(图2 A和B)。
　　 3、异土木香内酯对HEC-1细胞内P53和Bax蛋白的上调作用
　　 为了进一步探讨异土木香内酯对HEC-1细胞内P53和Bax蛋白的影响，使用异土木香内酯处理HEC-1细胞48小时后，通过Western blotting方法检测细胞内P53和Bax蛋白的变化。结果异土木香内酯作用HEC-1细胞48小时后，细胞内的P53和Bax蛋白表达显著上调(图2C)。
　　 4、半胱天冬酶抑制剂对异土木香内酯抑制HEC-1细胞增殖的翻转作用使用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的异土木香内酯处理HEC-1细胞，其细胞生存率分别为63.96％、34.67％和13.96％，使用20μmol/L的半胱天冬酶抑制剂与土木香内酯共同孵育HEC-1细胞后，其细胞生存率分别上升为81.91％、56.05％和52.15％。
　　 结论：异土木香内酯能显著抑制HEC-1细胞的增殖活性，而且其作用机制很有可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。但是诱导细胞凋亡是一个由多信号诱导、多基因调控、多因子参与的过程，异土木香内酯诱导肿瘤细胞凋亡的具体的机制还不是非常清楚，需要进一步研究。