PPARγ在人肺高转移及低转移涎腺腺样囊性癌细胞系中的表达研究

摘要

背景：涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常见的涎腺恶性肿瘤之一，其生物学性状主要是易发生远处转移，转移部位以肺为多见，预后较差，也是导致患者死亡的主要原因。远处转移是影响涎腺腺样囊性癌患者预后的重要因素。
　　 过氧化物增殖体激活物受体(peroxisome proliferators activated receptors，PPAR)是最新发现的一组核激素受体超家族成员。人类的PPAR有三种亚型：PPARα、PPARδ（亦称PPARβ）及PPARγ。其中，PPARγ是最具脂肪组织特异性的，也是研究最广泛的一种，在介导脂肪细胞分化和调节脂肪代谢中起着重要作用，参与糖尿病、动脉粥样硬化、炎症、肥胖等的病理生理过程。PPARγ基因定位于染色体3p25，含有9个外显子，其基因组结构覆盖100kb。许多研究表明PPARγ在人体多种器官恶性肿瘤中阳性表达，并且通过细胞抗增殖作用，诱导细胞凋亡和分化等机制，在应答于癌细胞的生长刺激的细胞核信号中发挥抗肿瘤作用。近年来有报道PPARγ配体能够独立或通过激活PPARγ抑制多种癌细胞的生长，并已应用于肺癌、乳腺癌等一些恶性肿瘤的治疗中。
　　 口腔颌面部恶性肿瘤中，腺样囊性癌(ACC)极易发生远处转移。而转移性和侵袭性是恶性肿瘤的重要特征，肿瘤若失去转移特性其恶性度将大大降低，对肿瘤转移相关基因的研究是攻克肿瘤不可缺少的重要基础工作之一。PPARγ作为目前研究最成熟的核激素受体，但PPARγ在SACC细胞中的表达及其与涎腺腺样囊性癌远处转移发生发展的关系少见报道。本实验采用western blot和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及实时定量PCR( Quantitative Real-time PCR)方法检测PPARγ在肺高转移性涎腺腺样囊性癌(SACC-LM)及肺低转移性涎腺腺样囊性癌(SACC-83)细胞系中表达水平差异，从而探讨PPARγ与涎腺腺样囊性癌肺转移的关系，对SACC的转移机制进行科学研究，探索核激素受体PPARγ与SACC转移的关系，进一步丰富对SACC转移的研究。
　　 目的：
　　 1.探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在涎腺腺样囊性癌人肺高转移细胞系SACC-LM与人肺低转移细胞系SACC-83中的表达。
　　 2.观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在涎腺腺样囊性癌人肺高、低转移细胞系中的表达差异。
　　 3.探讨PPARγ在SACC肺转移中的作用，并探讨PPARγ是否与涎腺腺样囊性癌(SACC)肺转移相关。
　　 方法：
　　 1.使用western blotting方法，培养细胞漂洗，悬浮，溶解，超声处理仪剪切DNA，离心，取上清。紫外分光光度计定量。取20-50μg样本蛋白，常规SDS-PAGE电泳，然后电转到PVDF膜上。50g/L脱脂奶粉封闭。加入PPARγ抗体(sc-7273，Santa Cruz公司1：200)，4℃孵育过夜，HRP标记二抗(1：2000)孵育，PBST洗脱，ECL化学发光后检测目的蛋白浓度，以42kD的β-actin为内参照。检测涎腺腺样囊性癌人肺高、低转移细胞系中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的表达
　　 2.利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) Trizol法抽提总RNA，所提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定，并经紫外分光光度计定量。将提取的RNA按逆转录试剂盒说明合成cDNA第1链。引物设计在不同的外显子上，以避免因基因组DNA的污染所造成的假阳性。PPARγ引物序列如下：上游引物：5′-ATGGCAATTGAATGTCGTGTC-3'；下游引物：5′-TCCGCCCAAACCTGATG-3′，所用内参为gapdh，上游引物：5'-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，下游引物：5′-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3′。引物由上海生物工程技术公司进行合成。PCR反应在Biometra热循环仪中进行。PCR产物行210％琼脂糖凝胶(含0.125μg/mlEB)电泳鉴定，反映PPARγ mRNA在SACC-83和SACC-LM细胞系中的表达。
　　 实时定量PCR（Quantitative Real-time PCR）方法将PPARγ和GAPDH的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，割胶回收纯化；制成标准品；将上述不同稀释度的两种标模板及待测样品以Eva Green作为荧光染料，按以下条件进行检测，每个样品做2个平行管以减少误差。反应体系：于PCR管中加入10×Buffer215μ1，dNTP(215mmol/L)，上游引物和下游引物各1μ1，Taq DNA聚合酶0.15μl，DNA模板1μ1，2×Eva（荧光染料）1125μ1，ddH2O至25μl。反应条件：95℃预变性15s;56℃退火20s，72℃延伸30s，循环40次；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性，以PPARγ与GAPDH相对浓度的比值来反映PPARγ表达量。以检测肺高转移性涎腺腺样囊性癌(SACC-LM)及肺低转移性涎腺腺样囊性癌（SACC-83）细胞系中PPARγ蛋白表达和PPARγmRNA的表达水平。
　　 结果：
　　 本实验观察到PPARγ蛋白及mRNA在SACC-LM细胞系及SACC-83细胞系中均有表达，与SACC-83细胞系相比，SACC-LM细胞系中PPARγ蛋白较高表达，并且SACC-LM细胞系中PPARγmRNA表达水平是SACC-83细胞中表达水平的4.346939倍(P＜0.01)。
　　 结论：1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)蛋白表达存在于涎腺腺样囊性癌的远处转移细胞中。2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)蛋白表达变化与涎腺腺样囊性癌的远处转移有关。3、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)mRNA的表达量同涎腺腺样囊性癌肺高、低转移细胞呈正相关。4、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在SACC肺高低转移细胞系中的差异表达，初步证实PPARγ在SACC远处转移方面有重要作用。

目录

文摘

英文文摘

PPARγ在人肺高转移及低转移涎腺腺样囊性癌细胞系中的表达研究

引言

第一部分 PPARγ在SACC-83和SACC-LM细胞系中蛋白表达水平的检测

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 PPARγ在SACC-83和SACC-LM细胞系mRNA水平的检测

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)与肿瘤研究进展

参考文献

综述二 涎腺腺样囊性癌肺转移的研究进展

参考文献

致谢

个人简历