家族性肌萎缩侧索硬化动物模型腰段脊髓泛素表达特征

摘要

目的：肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis， ALS）是一种进行性加重的神经系统变性疾病，选择性损害脊髓前角的运动神经元、脑干运动神经核运动神经元及大脑运动皮层的大锥体细胞，表现为进行性加重的肌肉无力、肌肉萎缩、肌束震颤、腱反射亢进，病理征阳性，最终呼吸衰竭死亡。90％～95％的ALS为散发性，5％～10％的ALS为家族性，约20％的家族性ALS与Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)基因突变有关。目前该病发病机制尚不清楚，但残存运动神经元中存在泛素阳性包涵体是ALS的重要病理特征之一。
　　 泛素是真核细胞中普遍存在且序列高度保守的小分子球形蛋白质，其分子量约8.5K Da，由76个氨基酸残基组成，能够共价结合细胞中的受体蛋白。泛素与泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、去泛素化酶、蛋白酶体及其底物（蛋白质）构成泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system， UPS)。UPS是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80％以上蛋白质的降解。大量研究认为UPS在错误折叠蛋白或其他突变蛋白的降解过程中也发挥重要作用。泛素蛋白酶体降解通路失调可导致异常蛋白在细胞内积聚，并进一步引起细胞功能紊乱及变性。UPS功能异常可以发生于UPS途径的任何一个环节，如泛素化过程中泛素量的失衡，泛素结合过程中泛素活化酶E1，泛素结合酶E2，泛素连接酶E3功能失调，蛋白酶体降解水平失调或去泛素化水平失调等。实验表明，在ALS包涵体中所见的泛素连接酶Dorfin能特异性结合并泛素化各种突变的SOD1，对野生型SOD1无影响。过量的Dorfin可减少SOD1包涵体的形成，从而保护神经元免受SOD1毒性的损害。因此，泛素蛋白酶体降解系统和ALS的发病可能存在密切关系。
　　 本实验应用家族性肌萎缩侧索硬化动物模型（SOD1G93A转基因小鼠）观察泛素在ALS病程不同阶段的表达情况，旨在探讨泛素蛋白在ALS的发病中的作用。
　　 方法：饲养繁殖家族性肌萎缩侧索硬化动物模型SOD1G93A转基因小鼠，参考Weydt，P．的描述将SOD1G93A转基因小鼠分为症状前期（60天），症状早期，终末期。对照组动物为实验组小鼠同窝非转人突变SOD1基因小鼠。
　　 1 10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，心脏灌注4％多聚甲醛固定20min，取小鼠脊髓腰段以4％多聚甲醛固定48h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规组织切片（5μm厚）。5μm厚的石蜡切片应用免疫组织化学SP的方法显示泛素在SOD1G93A转基因小鼠不同时期脊髓前角细胞的表达分布形式。
　　 2 10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，新鲜取小鼠脊髓腰段，液氮速冻，-80℃储藏，提取总蛋白用蛋白免疫印迹的方法检测泛素在SOD1G93A转基因小鼠不同时期腰段脊髓的表达量的情况。
　　 3 10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，新鲜取小鼠脊髓腰段，液氮速冻，-80℃储藏，提取RNA反转录后，扩增目的基因用PCR的方法检测泛素基因在SOD1G93A转基因小鼠不同时期脊髓前角的转录表达情况。
　　 4 计量资料用x±s表示，采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计处理。SOD1G93A转基因小鼠不同时期组与对照组泛素转录mRNA水平及蛋白表达水平的总体比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1 泛素免疫组织化学染色结果显示，对照组小鼠不同年龄阶段腰段脊髓前角神经元均有泛素表达，无明显差别。SOD1G93A转基因小鼠随病情进展，泛素阳性蛋白表达逐渐聚集，形成泛素阳性聚集体。
　　 2 SOD1G93A转基因小鼠的腰髓总蛋白免疫印迹结果显示，随着病情进展8.5K Da的单泛素及分子量17K Da以上的多聚泛素蛋白水平表达无明显增加(F=0.241，1.972，P＞0.05)，无统计学意义。
　　 3 SOD1G93A转基因小鼠的腰髓mRNA反转录后，SOD1G93A转基因小鼠不同时期组与对照组相比，泛素mRNA-UBA有差异(F=9.938，P＜0.05)。症状早期SOD1G93A转基因小鼠与对照组小鼠相比UBA无明显差异，P=0.08＞0.05。症状早期与症状前期SOD1G93A转基因小鼠相比UBA表达明显增加，有统计学意义，P=0.04＜0.05。终末期与症状前期SOD1G93A转基因小鼠相比UBA表达明显增加，有统计学意义，P=0.01＜0.05。SOD1G93A转基因小鼠病情进展过程中，各时期相比及各时期与对照组相比UBB均无明显差异（F=0.637，P=0.612＞0.05），无统计学意义。
　　 结论：家族性肌萎缩侧索硬化动物模型SOD1G93A转基因小鼠发病过程中，泛素蛋白聚集形成泛素阳性聚集体，但蛋白单体及形成泛素链的多聚泛素都没有增加，泛素mRNA-UBA基因表达增加，而UBB表达无明显增加，泛素蛋白合成未明显增加，说明蛋白经UPS降解过程中蛋白的泛素化出现异常。

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家族性肌萎缩侧索硬化动物模型腰段脊髓泛素表达特征

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结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 肌萎缩侧索硬化相关的胞浆包涵体

参考文献

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