GPR30在家族性肌萎缩侧索硬化动物模型腰段脊髓中的表达特征

摘要

目的:肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)选择性累及大脑皮层、脑干和脊髓前角的运动神经元，病发后肌肉进行性萎缩、无力，多于发病后2到5年内死于呼吸衰竭，是一种渐进性神经系统变性疾病。约90％～95％的ALS为散发性，称为散发性肌萎缩侧索硬化(SpradicamyotrophiclateralsclerosisSALS)，目前发病机制不清，多认为与氧化损伤、氨基酸兴奋性性毒性、凋亡、线粒体损伤、轴浆转运异常、细胞骨架异常等有关，但是，每一种假说都不能完全诠释其发病过程;另5％～10％的ALS为家族性(FimilyamyotrophiclateralsclerosisFALS)，认为其中20％的发病与SOD1基因突变有关，而且SOD1G93A基因突变模型是目前应用最广的ALS研究在体动物模型。
　　多年来的流行病学研究发现ALS发病存在明显的性别差异:男性发病率大于女性，并且该差异随年龄增长而减小[1]，女性比男性发病年龄相对较晚[2]。这提示ALS发病的性别差异或许源于雌激素(Estrogen，E)对神经元的保护作用。
　　雌激素(Estrogen，E)为甾体类固醇性激素，文献报道E的靶器官包括中枢神经系统[3-6]。并且有研究证明E是一种神经保护因子[7-9]，在许多神经变性疾病模型中具有促进神经元生存，保护组织完整性的作用[10-12]。越来越多的证据支持E在大脑的调节作用及其在年龄增长过程中维持大脑功能的重要性。年龄相关的E水平下降对大脑功能有不良影响，激素的减少与神经变性疾病的进展有关。
　　雌激素的生物学功能大部分由经典的雌激素核受体ERα/β通过调节基因转录来介导[13-14]，通常要数小时到数天起效，是经典的慢速基因通路。研究发现ERα/β主要分布在脊髓后角外层[15-18]，而在前角运动神经元几乎没有ERα/β的表达。大量研究发现，E2可以在数分钟甚至数秒内发挥改善血供、抗化、抗兴奋性毒性的作用，且为非ERα/β位点依赖型。这提示除了经典的慢速基因通路，E2还可以经非基因快速通路起效。继而有文献报道E可以通过膜受体G-proteincoupledreceptor30(GPR30)发挥其快速非基因作用[19]。两个独立的研究机构分别发现GPR30（又称GPER1）是一种新型雌激素受体[20-22]，并在中枢神经系统广泛分布[23-27]。近来的两项实验研究报道GPR30在脊髓自主神经系统和神经节有表达[28-29]。更有研究发现GPR30在脊髓前角运动神经元有表达，这项研究认为GPR30有可能介导了E2对于运动神经元的保护作用，并且发现雌激素不仅能通过激活GPR30发挥对运动神经元的保护作用，还可能通过上调GPR30的表达而增强其作用[30]。
　　SOD1G93A转基因小鼠（ALS小鼠）是FALS动物模型，其特征性临床表现为成年（12周左右）发病，后肢运动功能障碍并逐渐进展至终末期（17-20周）[31]。而有关GPR30在ALS小鼠脊髓表达情况的报道少见。
　　本实验应用SOD1G93A转基因小鼠，观察GPR30在ALS小鼠症状前期，症状早期和终末期腰段脊髓的表达特征，旨在探讨性激素(sexhormon)与ALS发病中的关系，为进一步研究奠定理论依据。实验内容分为三部分:
　　第一部分GPR30在不同时期ALS小鼠腰段脊髓前角运动神经元的表达
　　方法:
　　1、模型建立及分组
　　饲养繁殖SOD1G93A转基因雄性小鼠，参照韦尔切利1-5分评分法，发病时为4分，死亡时为1分，60天为症状前期，4分为症状早期，1分为终末期[32]。各对照组为同窝、同月龄不携带突变SOD1基因的小鼠。每组各3只小鼠。
　　2、取材
　　应用10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，4％多聚甲醛心脏灌注固定20min，取小鼠脊髓腰膨大，分别以4％多聚甲醛固定48h。
　　3、免疫组化染色
　　后固定的组织块震荡切片25μm厚，应用免疫组织化学的方法观察GPR30在ALS小鼠各时期腰段脊髓的表达分布特征。计数脊髓两侧前角GPR30免疫阳性α运动神经元数量，并观察脊髓前角有无GPR30免疫阳性的星形胶质细胞。脊髓前角α运动神经元数量的计数方法:对连续切片的每第五张切片的双侧脊髓前角的α运动神经元计数，每段腰髓观察10个切片。被计数的α运动神经元标准为:位于前角、直径＞25μm，细胞核清楚[33]。星形胶质细胞的认定标准为:位于前角，形状不规则，细胞核清楚，细胞突起粗短，分支多[34]。
　　4、统计学处理
　　应用SPSS13.0统计学软件对所得数据进行统计处理。采用均数±标准差表示腰段脊髓切片两侧脊髓前角α运动神经元计数之和，三组数据的比较采用单因素方差分析，两组数据的比较采用两个独立样本比较的t检验，以α=0.05为显著性检验标准。
　　结果:
　　1、SOD1G93A转基因小鼠的鉴定
　　子代鼠的基因组DNA经过PCR扩增之后、在GBOX-HR全自动凝胶成像系统下其琼脂糖凝胶电泳结果示(Fig.1):SOD1G93A转基因阳性小鼠PCR产物条带位于200-300bp之间(236bp)。没有此条带为非mSOD1的PCR产物，为非SOD1G93A转基因鼠，即阴性对照小鼠。
　　2、GPR30免疫组化
　　2.1ALS小鼠在症状前期、发病期、终末期腰段脊髓前角GPR30免疫阳性α运动神经元计数分别为17.87±4.10、11.93±2.94、2.87±0.83，随着ALS病情进展，免疫阳性α运动神经元数目逐渐减少，到终末期仅见极少数残存α运动神经元，且各时期间均有显著性差异(P＜0.05);对照组各时期α运动神经元计数分别为22.93±4.62、23.13±3.99、19.8±3.41，各时期间无显著性差异（P＞0.05）;各时期ALS小鼠GPR30免疫阳性α运动神经元数目与对照组相比均减少，且有显著性差异(Table1，Graph1)(Fig.2200×)。
　　2.2从分布部位看:对照组GPR30的表达在脊髓前角神经元胞浆内较均匀表达，核周围着色较深;而转基因鼠脊髓前角神经元GPR30着色不均，呈颗粒状深染，形成包涵体样的结构;而且，与对照组不同，可见着色的星形胶质细胞(Fig.2200×，Fig.3400×)。
　　结论:
　　GPR30在脊髓前角神经元有表达，主要在胞浆内表达;随病情进展，ALS转基因鼠GPR30免疫阳性运动神经元数量明显减少，着色不均，呈颗粒状深染，形成类包涵体样结构，并且出现GPR30阳性的星形胶质细胞。
　　第二部分GPR30在ALS小鼠脊髓前角细胞分布特征
　　方法:
　　1、取60天龄SOD1G93A转基因雄性小鼠及其对照组各3只。
　　2、取材
　　10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，心脏灌注4％多聚甲醛固定20min，取小鼠脊髓腰膨大，分别以4％多聚甲醛固定48h。
　　3、免疫荧光染色
　　后固定的组织块震荡切片30μm厚，应用免疫荧光三标染色的方法在激光共聚焦显微镜下观察GPR30在ALS小鼠腰段脊髓前角细胞的分布特征。
　　结果:
　　通过特异性免疫荧光三标的方法，我们发现GPR30在ALS小鼠脊髓前角α运动神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞均有特异性表达。在对照组，GPR30主要在α运动神经元和小胶质细胞表达，星形胶质细胞也存在GPR30阳性表达，但数目极少(Fig.4，5)。
　　结论:
　　GPR30在SOD1G93A转基因鼠呈现星形胶质细胞的异常表达。
　　第三部分GPR30在不同时期SOD1G93A转基因鼠星形胶质细胞的表达。
　　方法:
　　1、取第一部分所固定各组小鼠的脊髓腰膨大。
　　2、免疫荧光染色
　　后固定的组织块震荡切片30μm厚，应用免疫荧光三标染色的方法在激光共聚焦显微镜下观察GPR30在ALS小鼠腰段脊髓星形胶质细胞的表达。
　　结果:
　　随病情进展，SOD1G93A转基因鼠GPR30免疫阳性星形胶质细胞数量明显增多，荧光强度明显增强。而对照组各时期GPR30免疫阳性星形胶质细胞都很少，荧光强度无明显增强(Fig.6-11)。
　　结论:
　　随病情进展，SOD1G93A转基因鼠GPR30免疫阳性星形胶质细胞数量明显增多，荧光强度明显曾强。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 GPR30在ALS小鼠各时期腰段脊髓前角运动神经元的表达

材料与方法

结果

附图

附表

第二部分 GPR30在ALS小鼠脊髓前角细胞的分布特征

材料与方法

结果

结论

附图

第三部分 不同时期SOD1G93A转基因鼠GPR30免疫阳性星形胶质细胞的表达

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

结论

参考文献

综述 雌激素与神经系统变性疾病

致谢

个人简历