调脂药物与缬沙坦对高脂模型大鼠动脉粥样硬化的作用及其分子机制研究

摘要

心脑血管疾病的基础是动脉粥样硬化(atheosclersisis，AS)，动脉粥样硬化可使动脉管壁增厚、变硬、管腔狭窄，导致很多心脑血管事件发生。在对动脉粥样硬化和冠心病的防治过程中，低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL-C)研究一直占据主要地位，现代流行病学和大量研究证实，动脉粥样硬化和冠心病的发生与LDL-C水平呈正相关，但目前的降低低密度脂蛋白胆固醇治疗只能减少1/3的心脏事件，美国Framingham Heart Study等研究显示：高密度脂蛋白胆固醇(Highdensity lipoprotein cholesterol HDL-C)水平与冠心病的发生率呈负相关，因此如何升高HDL-C的已成为人们关注的一个热点。
　　 HDL具有多种抗动脉粥样硬化的作用，主要通过参与体内胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport，RCT)发挥其抗AS功能，在降低低密度脂蛋白的同时，升高HDL-C及增加RCT不仅能有效抗动脉粥样硬化，还能有效逆转动脉粥样硬化斑块。
　　 ATP结合盒转运体A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)是升高HDL-C及增加RCT的关键基因，其编码的ABCA1蛋白参与胆固醇逆转运及在HDL生成的起始步骤中起着极重要的作用，如果ABCA1功能障碍或表达不足，就会导致apoA-I不能获得脂质而快速降解，引起HDL严重缺乏，外周细胞胆固醇沉积，促进动脉粥样硬化的形成与发展。
　　 ABCA1受多种因素的调节，目前研究比较多的在转录水平上调节ABCA1的因子就是肝X受体/视黄醇X受体(LXR/RXR)。当配体与它们结合后，核受体LXR和RXR形成异源二聚体，受氧化胆固醇和视黄酸所激活，然后结合到ABCA1启动子的识别序列DR-4上，增强ABCA1基因的转录。
　　 过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferatoractivatedreceptors，PPARs)属于核内激素受体超家族成员，研究最多的是PPAR-γ，现发现PPAR-γ在炎症、动脉粥样硬化和糖代谢的调节中起到重要的调节作用。近来发现，在人类和小鼠粥样斑块损伤中可见PPAR-γ明显表达，提示PPAR-γ在粥样硬化中起重要作用，在动脉粥样硬化的慢性炎症过程中，PPAR-γ可以下调黏附分子的表达，减少炎症细胞聚集；还可以通过与LXR或RXR结合形成异二聚体，进一步调节靶基因的转录，即通过PPAR-γ-LXRα-ABCA1的通路表达。
　　 现代认为动脉粥样硬化疾病同时也是一种血脂与炎症共同参与的慢性疾病。高敏C反应蛋白(hign-sensitivity C-reactiveprotein，hs-CRP)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-a)、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-8(Interleuk in-8，IL-8)是重要的促炎症因子，参与了动脉粥样硬化的形成及发展过程。
　　 目前，已公认ABCA1是影响HDL-C水平及胆固醇逆转运的重要基因，但ABCA1在AS发生中的作用及其机制仍未完全明确，尤其一些药物干预后对ABCA1的影响研究较少，如他汀类、贝特类的应用对ABCA1表达的具体影响机制还不明确；据报道血管紧张素受体拮抗剂有抗动脉粥样硬化的作用，但是对ABCA1的表达是否有影响，研究很少，本课题拟从分子水平观察调脂药物包括瑞舒伐他汀和非诺贝特及血管紧张素受体拮抗剂缬沙坦干预后对动脉粥样硬化的影响，主要探讨从PPAR-LXRABCA1通路及炎症因子在动脉粥样硬化发生发展中的分子机制，本实验分为三部分：
　　 第一部分调脂药物和缬沙坦对高脂模型大鼠动脉粥样硬化及炎性因子的影响
　　 目的：通过建立高脂血症动脉粥样硬化大鼠模型，动态、系统监测瑞舒伐他汀、非诺贝特、缬沙坦干预前后动脉粥样硬化及炎性因子水平的变化。
　　 方法：将50只雄性健康Wistar大鼠随机分为5组：正常对照组、高脂模型组、瑞舒伐他汀药物组、非诺贝特药物组和缬沙坦药物组。采用高脂饲料喂养的方法建立高脂模型，从第9周开始，高脂模型对照组和药物干预组分别给予生理盐水或瑞舒伐他汀2mg/(kg．d)或非诺贝特30mg/(kg．d)或缬沙坦14mg/(kg．d)灌胃，于第18周末，处死大鼠，采取血液及主动脉，测量各组血脂及CRP、TNFα、IL-6、IL-8的水平，同时采用Trizol法提取RNA，用RT-PCR法测量主动脉中hs-CRPmRNA，TNF-αmRNA，IL-6mRNA的表达。一部分主动脉用于HE染色观察动脉内膜的改变。
　　 结果：
　　 1、实验各组血脂水平的变化
　　 第8周末，与正常对照组相比，高脂模型各组TC，LDL-C水平明显增高(P＜0.05)证明高脂模型建立成功．
　　 第18周末，与高脂模型对照组比较，瑞舒伐他汀组TC(11.09±2.55vs5.78±0.46mmol/L)、LDL-C(2.16±0.58mmol/Lvsl.34±0.23mmol/L)均降低，有统计学差异，非诺贝特、缬沙坦组TC、LDL-C均降低但无统计学差异。HDL-C在药物干预组有升高的趋势，从1.18±0.26mmol/L到1.29±0.30mmol/L，但无统计学意义．
　　 2、实验各组hs-CRP、TNF-a、IL一6、IL-8的水平及mRNA表达结果
　　 第18周末，与正常对照组比较，高脂模型组的hs-CRP、TNF-a、IL-6、IL-8均升高，其中hs-CRP从85.32±28.50ug/ml升高到166.10±21.10ug/ml(p＜0.05)、IL-8从270.83±20.10pg/ml升高到410.21±29.28pg/ml(p＜0.05)TNF-a从0.90±0.26升到1.54±0.19ng/ml(p＜0.05)、IL-6从90.08±38.35到166.86±54.38pg/ml(p＜0.05)。
　　 应用瑞舒伐他汀组、非诺贝特和缬沙坦治疗10周后，炎性因子有下降的趋势，其中hs-CRP分别下降为(62.29±10.76、64.56±11.68、68.68.26±12.78)p＜0.05;但CRPmRNA的表达在药物干预组全部下降，与高脂模型组有统计学意义(p＜0.05)。
　　 应用瑞舒伐他汀组、非诺贝特和缬沙坦治疗10周后，与高脂模型对照组比较，TNF-a的水平及mRNA表达均降低，瑞舒伐他汀组从1.54±0.19下降为0.98±0.14有统计学差异(p＜0.05)；但TNF-amRNA的表达在药物干预组全部下降，与高脂模型组有统计学意义(p＜0.05)
　　 应用瑞舒伐他汀组、非诺贝特和缬沙坦治疗10周后，与高脂模型对照组比较，IL-6的水平及mRNA表达均降低，缬沙坦组有统计学差异，从166.86±54.38下降为92.27±31.40(p＜0.05)；但IL-6mRNA的表达在药物干预组全部下降，与高脂模型组有统计学意义(p＜0.05)
　　 应用瑞舒伐他汀组、非诺贝特和缬沙坦治疗10周后，与高脂模型对照组比较，瑞舒伐他汀组IL-8水平表达下降明显，从410.21±29.28到310.12±28.01,(p＜0.05)。
　　 3、病理形态学变化：瑞舒伐他汀药物干预组与高脂模型对照组比较内膜增生不明显，泡沫细胞减少。非诺贝特、缬沙坦药物干预组内膜病变较高脂模型有不同程度的减轻。
　　 结论：
　　 1、调脂药物瑞舒伐他汀、非诺贝特抗动脉粥样硬化作用，不仅与降低血脂有关，还与抑制炎症反应有关。
　　 2、缬沙坦能够有效地降压的同时，能减少部分炎性因子释放的作用，发挥其抗动脉粥样硬化的作用。
　　 第二部分调脂药和缬沙坦对高脂模型大鼠ABCAlmRNA及蛋白表达的影响
　　 目的：在前期动态监测了调脂药物及缬沙坦干预前后动脉动脉粥样硬化及炎性因子的改变基础上，探讨了瑞舒伐他汀、非诺贝特、及缬沙坦药物干预前后ABCA1表达的变化。
　　 方法：50只雄性健康Wistar大鼠，随机分为5组：正常对照组、高脂模型组、瑞舒伐他汀组、非诺贝特组、缬沙坦组。通过高脂饲料喂养法建立高脂模型；第9周开始，高脂模型对照和药物干预组分别给予生理盐水或瑞舒伐他汀2mg/(kg．d)或非诺贝特30mg/(kg．d)或缬沙坦14mg/(kg．d)灌胃10周后处死大鼠，留取肝组织和主动脉全长（从主动脉弓起始到腹主动脉分支处），采用Trizol法提取RNA，应用RT-PCR方法测量各组肝脏和血管中ABCAl mRNA的表达，应用Western-blot方法测量ABCA1蛋白的表达。
　　 结果：
　　 1、瑞舒伐他汀、非诺贝特和缬沙坦对肝脏ABCA1mRNA和蛋白表达的影响
　　 高脂模型组肝脏ABCA1的mRNA及蛋白表达与正常对照组相比虽然有轻度的升高，但无统计学差异，（p＞0.05）。瑞舒伐他汀、非诺贝特药物干预10周后大鼠肝脏ABCA1的mRNA分别为1.2±0.07、0.90±0.08，较模型组明显升高，差异有统计学意义，（p＜0.05）；大鼠肝脏ABCA1蛋白表达水平分别为0.42±0.01、0.50±0.02和0.51±0.02，均有不同程度的升高，与模型组相比有统计学差异（p＜0.05）。
　　 2、瑞舒伐他汀、非诺贝特和缬沙坦对血管ABCAlmRNA和蛋白表达的影响
　　 给予高脂饲料喂养后，高脂模型组大鼠主动脉ABCA1的mRNA及蛋白表达水平，与正常对照组相比无统计学差异，（p＞0.05）。瑞舒伐他汀、非诺贝特及缬沙坦药物干预10周后大鼠主动脉ABCA1的mRNA分别为1.18±0.02、1.08±0.09和0.87±0.05，较模型组明显升高，差异有统计学意义，（p＜0.05）；大鼠主动脉ABCA1蛋白表达水平均有不同程度的升高：0.43±0.01、0.51±0.02和0.52±0.02，与模型组相比具有统计学差异，(p＜0.05）
　　 结论：
　　 1、瑞舒伐他汀、非诺贝特不仅降低血脂，而且可使ABCA1的含量升高。
　　 2、缬沙坦改善动脉粥样硬化方面，可能与升高ABCA1的含量有关。
　　 第三部分调脂药和缬沙坦对动脉粥样硬化大鼠肝脏及主动脉PPAR-γ及肝χ受体表达的影响
　　 目的：通过应用瑞舒伐他汀、非诺贝特以及缬沙坦对高脂模型大鼠肝脏和主动脉中PPAR-γ及肝χ受体LXR的mRNA和蛋白质的影响，进一步探讨其升高ABCA1的分子机制。
　　 方法：50只雄性健康Wistar大鼠，随机分为5组：正常对照组、高脂模型组、瑞舒伐他汀组、非诺贝特组、缬沙坦组。通过高脂饲料喂养法建立高脂模型；第9周开始，高脂模型对照和药物干预组分别给予生理盐水或瑞舒伐他汀2mg/(kg．d)或非诺贝特30mg/(kg．d)或缬沙坦14mg/(kg．d)灌胃10周后处死大鼠，留取肝组织和主动脉全长（从主动脉弓起始到腹主动脉分支处），采用Trizol法提取RNA，应用RT-PCR方法测量各组肝脏和血管中PPAR-γmRNA和LXRα的表达，应用Western-blot方法测量肝脏和血管中PPARγ和LXRα蛋白的表达。
　　 结果：
　　 1、瑞舒伐他汀、缬沙坦药物干预后促进肝脏、血管PPARγmRNA、PPAR-γ蛋白的表达：
　　 与高脂模型组比较，瑞舒伐他汀及缬沙坦药物干预后，大鼠肝脏的PPAR-γmRNA分别为0.36±0.04和0.38±0.03，大鼠主动脉的PPAR-γmRNA分别为0.44±0.04和0.45±0.02，两组均明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)，非诺贝特组无统计学差异。
　　 与高脂模型组比较，瑞舒伐他汀和缬沙坦药物干预后，大鼠肝脏PPAR-γ蛋白表达分别为0.45±0.01和0.45±0.02，血管中的表达为0.29±0.01和0.42±0.01，变化趋势与mRNA的表达趋势一致。两组均明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　 2．瑞舒伐他汀、非诺贝特干预后促进了肝脏、血管肝x受体LXR-a的mRNA的表达：
　　 与高脂模型组比较，瑞舒伐他汀、非诺贝特药物干预后肝脏中LXRαmRNA升高（分别为0.52±0.05、0.60±0.08，），有统计学意义(p＜0.05)；血管中LXR-αmRNA升高(0.67±0.08、0.82±0.07)；缬沙坦干预组升高但无统计学差异(p＞0.05)。
　　 3、与高脂模型组比较，瑞舒伐他汀、非诺贝特、缬沙坦药物干预后肝脏、血管肝x受体α的蛋白表达升高，均有统计学意义(p＜0.05)。
　　 结论：
　　 1．瑞舒伐他汀能促进肝脏和血管PPAR-γ和LXR-α的表达。
　　 2．缬沙坦可促进PPAR-γ和LXR-α的表达。
　　 3．非诺贝特能够升高LXR-α的表达和促进ABCA1的释放，并非通过激活PPAR-γ途径，可能通过激活其他途径实现。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写

调脂药物和缬沙坦对高脂模型大鼠动脉粥样硬化的作用及其分子机制研究

引言

第一部分 调脂药物和缬沙坦对高脂模型大鼠动脉粥样硬化及炎性因子的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 调脂药物和缬沙坦对高脂模型大鼠ABCA1mRNA及蛋白表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 调脂药和缬沙坦对高脂模型大鼠肝脏及主动脉PPAR-γ及肝x受体表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一

参考文献

综述二

参考文献

致谢

个人简历