哇巴因抗肿瘤生长作用及对A549细胞迁移的作用

摘要

强心苷类药物是一类主要用于治疗心力衰竭和心房颤动的常用药物，作用靶点是Na+/K+-ATPase。二十世纪八十年代，Stenkvist等发现，在服用洋地黄类药物的妇女中，患乳腺癌的几率比不服用药物的患者要少很多，肿瘤细胞呈现更多的良性特征。Haux等在9271位服用洋地黄毒苷的患者中发现，洋地黄毒苷的血药浓度越高，患者患白血病、淋巴瘤以及肾脏或泌尿道肿瘤的风险越低。自此，一些学者开始关注强心苷类药物的抗肿瘤作用。地高辛、洋地黄毒苷等强心苷类药物可抑制多种肿瘤细胞的生长。一些研究认为，Na+/K+-ATPaseα亚单位可能是强心苷类药物抗肿瘤作用的主要靶点，但Na+/K+-ATPaseα各亚型与强心苷类药物抗肿瘤作用之间的关系尚不清楚，在四个亚型中，更多的研究集中在α1、α2、α3亚型上。有研究报道，强心苷类的作用可能与其影响细胞内信号转导有关。本实验中，我们研究了Na+/K+-ATPase抑制剂哇巴因对肿瘤细胞生长的影响以及与Na+/K+-ATPaseα1、α、α3关系，并进一步研究了哇巴因对Src/EGER通路的影响。
　　肿瘤转移是恶性肿瘤的主要特征和导致癌症患者死亡的重要因素。来源于上皮组织的肿瘤细胞迁移到远处的过程中，经常发生上皮-间质化(EMT)，在EMT过程中，细胞的侵袭力增强，E-钙粘素(E-cadherin)、N-钙粘素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)是EMT的重要标志物。非小细胞性肺癌A549具有Ⅱ型肺泡上皮的重要特征，EMT是A549获得侵袭和迁移能力的重要过程。本实验通过细胞划痕实验和Transwell小室法来检测哇巴因对A549细胞迁移能力的影响，并研究哇巴因对E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2(基质金属蛋白酶-2)、MMP-9(基质金属蛋白酶-9)等蛋白表达的影响。
　　一、哇巴因抑制肿瘤细胞生长作用与Na+/K+-ATPaseα亚基的关系
　　目的：
　　1、研究哇巴因抑制肿瘤细胞生长作用及其与Na+/K+-ATPaseα1、α2、α3亚基表达的关系。
　　2、研究哇巴因对Src、EGFR和P13K蛋白表达的影响。
　　方法：本实验采用四甲基噻唑蓝法(MTT法)来研究不同浓度的哇巴因对肿瘤细胞的生长抑制作用。采用蛋白免疫印迹法(western blot)研究哇巴因对细胞Na+/K+-ATPaseαl、α2、α3亚基、Src、、EGFR和P13K蛋白表达的影响
　　结果：
　　1、哇巴因可时间-浓度依赖性抑制四种肿瘤细胞的生长，对A549的抑制作用最为明显，其次是TE-1细胞和EC-109细胞，最弱的是SK-BR-3细胞。
　　2、EC-109细胞Na+/K+-ATPaseα1蛋白含量最多，其次是SK-BR-3和A549细胞，TE-1细胞含量最少；A549细胞Na+/K+-ATPaseα2蛋白含量最多，其次是EC-109、TE-1、SK-BR-3；四种细胞Na+/K+-ATPaseα3蛋白含量无明显差别。
　　3、Na+/K+-ATPaseα1、α2和α3抗体可阻断哇巴因对A549细胞的生长抑制作用。
　　4、哇巴因可下调A549和SK-BR-3细胞中Na+/K+-ATPaseα1、α2和α3蛋白表达。同浓度(100 nM)哇巴因对A549的Na+/K+-ATPaseα1、α2和α3蛋白下调作用比对SK-BR-3细胞要明显。
　　5、哇巴因可下调A549和SK-BR-3细胞中Src、EGFR、P13K蛋白表达。同浓度(100 nM)哇巴因对A549细胞上述蛋白下调作用比对SK-BR-3细胞要明显。
　　6、Src抑制剂PP210μM和P13K抑制剂LY29400250μM不影响A549细胞Na+/K+-ATPaseα1、α2、α3亚基的表达
　　结论：哇巴因对肿瘤细胞的生长抑制程度不同与Na+/K+-ATPaseα1、α2、α3含量无关；Na+/K+-ATPaseα1、α2和α3亚基都参与哇巴因对A549细胞的作用；哇巴因抑制生长作用可能与其下调Na+/K+-ATPaseα亚基、Src、EGFR和PI3K蛋白有关。
　　二、哇巴因对A549细胞迁移的作用
　　目的：研究哇巴因对人肺癌A549细胞迁移的作用。
　　方法：通过细胞划痕实验和Transwell小室法来检测A549细胞的迁移能力；采用western blot研究哇巴因对E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9等蛋白表达的影响。
　　结果：
　　1、在50ng/ml的EGF诱导后，细胞变得更为狭长，边缘伸出长角，细胞之间由原来的紧密连接变得松散。EGF刺激可明显增加A549细胞Vimerain蛋白表达，略增加N-cadherin蛋白表达，对E-cadherin蛋白表达没有影响。
　　2、哇巴因可抑制正常A549细胞的迁移速度，也抑制了EGF诱导的A549细胞的迁移速度。
　　3、哇巴因可降低Vimentin、N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白表达，对E-cadherin蛋白表达没有影响。
　　结论：哇巴因可抑制A549细胞的迁移，可能与其下调MMP-2、MMP-9的表达有关。