中药复杂体系中呋喃香豆素类同分异构体的HPLC-MS分析及半枝莲中黄酮类成分的药代动力学研究

摘要

高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)集HPLC的高效分离能力和MS的高灵敏度、强结构定性功能于一体，成为中药化学成分鉴定的有力分析工具。呋喃香豆素类化合物是多种中药的主要活性成分，因其抗病毒、抗肿瘤、抗菌，特别是抗HIV活性而受到广泛关注。呋喃香豆素中存在多种同分异构体，如何在复杂体系中鉴定这些分子量相同、结构相似的异构体，成为主要以质量数识别化合物的HPLC-MS技术面临的难题。本研究即以呋喃香豆素类同分异构体为研究对象，以北沙参、白芷、前胡、独活和补骨脂为研究载体，以HPLC-MS技术为分析手段，通过总结质谱裂解规律，建立HPLC-EPI液质联用新扫描方式，探讨中药复杂体系中同分异构体鉴定的方法学，以期为同分异构体的质谱研究提供新方法和新思路。
　　半枝莲(Scutellaria barbata)为唇形科植物半枝莲(Scutellaria barbata)的干燥全草。《中国药典》记载本品味辛、苦，性寒，归肺、肝肾经，具有清热解毒、散瘀止血、利尿清肿的功能，是临床常用中药。黄酮类化合物是半枝莲的主要生理活性物质。本研究以专属性强、灵敏度高的HPLC-MS技术为分析手段，采用水解和不水解2种血浆样品处理方式，分别测定了大鼠灌胃半枝莲后血浆中5种黄酮类成分的游离型含量和总量，初步探讨了半枝莲中黄酮类化合物的药代动力学特征。
　　第一部分呋喃香豆素类同分异构体的质谱裂解规律研究
　　目的：研究呋喃香豆素类同分异构体在软电离技术(大气压化学电离源和电喷雾离子源)下质谱裂解差异和规律，建立稳定、快速的可用于鉴定呋喃香豆素类同分异构体的质谱方法。
　　方法：分别配制补骨脂素/异补骨脂素、花椒毒素/佛手柑内酯、欧前胡素/异欧前胡素、茴芹内酯/异茴芹内酯4对呋喃香豆素类同分异构体对照品的甲醇储备液，用甲醇-水(1:1，v/v)分别稀释至浓度为1μg/mL。针泵进样，流速为10μL/min。通过大气压化学电离源(APCI)和电喷雾离子源(ESI)下正负离子多级扫描、母离子扫描、中性丢失扫描研究其质谱裂解途径和差异，采集在不同碰撞诱导解离电压下子离子扫描中主要碎片的相对丰度值，采集时间为2 min。
　　结果：1.系统总结了区分呋喃香豆素类同分异构体的7个质谱裂解规律，如相对丰度比区分法、利用特征性离子m/z203和185或用[M+NH4]+和[M+Na]+峰的相对丰度值区分取代基的位置等。2.发现区分呋喃香豆素同分异构体的共性质谱规律-相对丰度比法。公式为R=M/N，M和N分别代表互为同分异构体的一对香豆素类化合物各自主要碎片离子的相对丰度比值。对于单氧(双氧)取代的化合物，当R值大于1时，M为C-5(C-8较活泼取代基)取代的化合物，N为C-8(C-5较活泼取代基)取代的化合物。
　　结论：本法首次系统地将主要碎片离子丰度比法用于呋喃香豆素类同分异构体的区分。总结的质谱裂解规律稳定性好、特征性强，可用于呋喃香豆素同分异构体的质谱快速鉴定。
　　第二部分 HPLC-EPI液质扫描模式的建立及其在中药成分分析中的应用
　　目的：建立一种可获得稳定性高、重现性好、专属性强的化合物质谱信息的分析方法，并用于多种中药材复杂体系中化合物的分析与鉴定。
　　方法：配制补骨脂素/异补骨脂素、花椒毒素/佛手柑内酯、欧前胡素/异欧前胡素、茴芹内酯/异茴芹内酯4对呋喃香豆素类同分异构体的混合标准溶液，浓度分别为1μg/mL。采用超声提取法制备北沙参、白芷、独活、前胡和补骨脂的50％乙醇提取液，减压蒸干，残渣复溶于50％甲醇中，高速离心取上清液，作为供试品溶液。采用C18柱进行色谱分离，流动相为1 mmol/L的醋酸铵水-甲醇，梯度洗脱。质谱检测采用ESI源，正离子扫描，增强型子离子扫描(EPI)模式，扫描离子为各个化合物的[M+H]+峰，线性离子阱填充时间为30 ms，Q0富集，在碰撞电压为25、30和40 eV下进行检测。对HPLC-EPI模式中分析物质谱信息进行精密度与稳定性的研究，记录HPLC-EPI模式与多离子监测-信息依赖-增强子离子扫描(HPLC-MRM-IDA-EPI)模式和母离子扫描-信息依赖-增强子离子扫描(HPLC-PREC-IDA-EPI)模式在相同检测条件下主要碎片离子的相对丰度值，采用SPSS16.0中的波动性差异进行统计比较分析。
　　结果：HPLC-EPI模式中，混合标准溶液和供试品溶液中待测化合物的碎片离子相对丰度值的精密度和稳定性的相对标准偏差(RSD)均小于10％，质谱信息较为稳定。在HPLC-MRM-IDA-EPI与HPLC-PREC-IDA-EPI模式中，待测化合物的碎片离子丰度值波动在0.0-13.7％之间，而HPLC-EPI模式中，待测化合物的碎片离子丰度值波动在0.0-2.3％之间。这说明在HPLC-EPI模式下更有利于得到稳定的质谱信息。
　　结论：本法稳定性高、重现性好、专属性强，可用于在中药复杂分析体中化合物稳定质谱信息的获得和鉴定。
　　第三部分北沙参、白芷、前胡、独活和补骨脂中呋喃香豆素类同分异构体HPLC-MS鉴定
　　目的：鉴定和识别北沙参、白芷、前胡、独活和补骨脂中呋喃香豆素类同分异构体。
　　方法：采用超声提取法制备5种药材的50％乙醇提取液，减压蒸干，残渣复溶于50％甲醇中，高速离心取上清液进行HPLC-MS分析。联合使用HPLC-EPI、HPLC-MRM-IDA-EPI和HPLC-PREC-IDA-EPI3种扫描模式，结合呋喃香豆素类同分异构体的质谱裂解规律，鉴定北沙参、白芷、前胡、独活和补骨脂中呋喃香豆素类同分异构体。根据母离子扫描中同时出现的[M+H]+和[M+NH4]+峰离子信息判断未知呋喃香豆素类化合物的分子量，根据3种模式产生的碎片离子信息及主要裂解途径上碎片离子的相对丰度比规律区分呋喃香豆素类同分异构体。采用C18柱进行色谱分离，流动相为1mmol/L醋酸铵水-甲醇，梯度洗脱。
　　结果：鉴定出5种中药材中18对呋喃香豆素类同分异构体。其中，北沙参中9对，白芷中12对，前胡中8对，独活中7对，补骨脂中5对。
　　结论：HPLC-EPI扫描模式与呋喃香豆素类同分异构体质谱裂解规律的有机结合，可快速、稳定的区分5种中药复杂分析体系中18对呋喃香豆素类同分异构体。
　　第四部分半枝莲中5种黄酮类成分的药代动力学研究
　　目的：建立可同时测定大鼠血浆中游离型和结合型野黄芩苷、柚皮素、芹菜素、木犀草素和汉黄芩素含量的HPLC-MS方法，并用于大鼠灌胃给与半枝莲提取物后该5种成分的药代动力学研究。
　　方法：大鼠灌胃给与半枝莲提取物(2.35 mL/kg)后，分别于给药后0.08，0.5，4，5，6，8，12，24，36，48 h眼内眦静脉丛取血，每次取0.3 mL制备血浆样品，将血浆均分成两部分，分别采用酸水解并液-液萃取和直接液-液萃取两种方法进行样品预处理，提取溶剂为乙酸乙酯，磺胺甲恶唑为内标。色谱柱为C18柱，流动相为0.01％乙酸水-甲醇(35:65，v/v)，运行时间为12.5 min。采用电喷雾离子源(ESI)，负离子扫描，多反应监测(MRM)模式进行检测。5种被测成分和内标的监测离子对分别为野黄芩苷m/z461.1/285.1，柚皮素m/z271.0/119.0，芹菜素m/z269.0/117.0，木犀草素m/z285.0/132.9，汉黄芩素m/z283.0/268.0，磺胺甲恶唑m/z252.0/155.9。
　　结果：所有标准曲线在线性范围内线性关系良好(r≥0.9915)，最低定量限(LLOQ)≤9.15ng/mL。日内、日间精密度的相对标准偏差(RSD)均小于14.8％，相对误差(RE)为-12.4-14.0％，提取回收率为53.8-84.2％，基质效应为81.9-103.3％。大鼠灌胃半枝莲提取物后，血浆中该5种成分的游离型t1/2在4.95-9.56 h之间，磁在0.001到0.0024之间，说明这5种成分在体内消除较慢。除野黄芩苷出现了双峰现象外，其余4种成分的游离型药时曲线具有一致性。柚皮素、芹菜素、木犀草素和汉黄芩素结合型的AUC0→∞占总AUC0→∞的54.5-81.3％，并且结合型的Cmax是游离型的2倍之多，说明黄酮苷元类在体内极易转化成其结合形式存在并可能存在首过效应。
　　结论：本法专属性强、灵敏度高、重现性好，可用于大鼠灌胃给与半枝莲提取物后血浆中野黄芩苷、柚皮素、芹菜素、木犀草素和汉黄芩素的药代动力学研究。