前胡质量评价方法及呋喃香豆素类同分异构体质谱分析方法研究

摘要

前胡为伞形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根。《中国药典》记载前胡有降气化痰、散风清热的功效，用于痰热喘满，咳痰黄稠，风热咳嗽痰多等症。香豆素类化合物是前胡中的主要化学成分，包括角型吡喃香豆素、呋喃香豆素和其他香豆素，是前胡质量评价的重要指标。目前对前胡的质量研究集中在化学成分的定性分析，或对少数香豆素成分进行定量分析，尚缺乏对前胡药材中香豆素类化合物进行全面鉴定和定量分析的方法。本研究针对前胡质量评价中存在的问题进行了以下两方面研究：1采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱技术（UHPLC-Q-TOF-MS/MS），建立了前胡中香豆素类成分同时鉴定和定量的分析方法，并对不同前胡样品和混淆品进行比较。2依据《欧洲药典》起草了前胡的质量标准。包括性状，粉末显微鉴别，薄层色谱法鉴别，水分、总灰分和酸不溶性灰分的检查，白花前胡甲素和白花前胡乙素的高效液相色谱法含量测定。
　　呋喃香豆素类化合物广泛分布于高等植物中，其基本骨架由苯并?吡喃酮和呋喃环构成，分为线型和角型两种，并常以C-5位和C-8位不同取代的同分异构体形式共存。由于同分异构体具有分子量相同、结构相近和理化性质相似等特点，通常具有相似的色谱行为和质谱裂解特征而不易区分。本文采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术，通过研究4对呋喃香豆素同分异构体，总结了特征碎片离子的相对丰度比法（RRA）用以区分C-5位和C-8位不同取代的同分异构体，并将此方法用于白芷中呋喃香豆素同分异构体的区分，为中药复杂体系中异构体的研究提供了新思路。
　　第一部分前胡中香豆素类化合物同时鉴定和定量分析方法的建立及其在前胡与混淆品分析中的应用
　　目的：采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术，建立同时鉴定和定量分析前胡中香豆素类成分的方法，并评价不同前胡样品和混淆品的质量。
　　方法：
　　1.检测条件：采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术对样品进行检测。色谱柱为Thermo Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm，3μm），流动相为1 mmol/L乙酸铵水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脱，流速为0.5 mL/min；进样量5μL。高分辨质谱采用ESI源，正离子模式，一级全扫描采集，采用动态背景扣除和信息依赖采集触发二级碎片的采集，每一循环采集12个最强峰的二级质谱图。
　　2.样品制备：甲醇作为提取溶剂，采用超声处理的方式制备样品。
　　3.化合物鉴定和定量分析：将已知的化学式输入数据处理软件MasterView中，对误差范围在±5 ppm内的色谱峰基于精确分子质量和一级、二级质谱图，结合香豆素的裂解规律和文献中已报道的化合物的裂解途径进行鉴定；在进行鉴定的同一分析周期内，对有对照品的9个成分白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E、欧前胡素、异欧前胡素、花椒毒素、佛手柑内酯、补骨脂素和异茴芹内酯进行绝对定量，对所有色谱峰得到专属分离的化合物采用峰面积进行相对量测定。
　　4.样品分析：以对照药材中各定量化合物的峰面积为标准，其他样品中各化合物峰面积与之比较，产生峰面积比值，基于峰面积比值的和及主成分分析法对23批前胡样品进行分析。依据已鉴定的化合物对13批前胡混淆品进行分析。
　　结果：应用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析鉴定了前胡中54个香豆素类化合物，包括36个角型吡喃香豆素、13个呋喃香豆素和5个其他香豆素。其中色谱峰得到专属分离的化合物共29个。9种成分在测定浓度范围内线性关系良好，仪器重复性、检测限、定量限、精密度、准确度和稳定性均符合要求。9种化学成分在所有批次样品中的总含量范围为694.57~26532.10μg/g，RSD值为51％。29个化合物中有8个角型吡喃香豆素和2个呋喃香豆素的峰面积在样品中较大。PCA分析结果表明前胡香豆素E、白花前胡甲素和3'-（异戊酰氧基/2-甲基丁酰氧基）-4'-（异戊酰氧基/2-甲基丁酰氧基）凯尔消旋内酯的含量是评价前胡药材质量的关键因素。对13批前胡混淆品的分析结果表明紫花前胡、少毛北前胡、毛前胡和石防风具有与白花前胡一定相同的物质基础，且可以分别利用15、13、14和31个香豆素成分区分白花前胡与紫花前胡、少毛北前胡、毛前胡和石防风。前胡混淆品隔山香不具有与白花前胡相似的物质基础。前胡已鉴定的54个化合物中有8个化合物（6个角型吡喃香豆素、1个呋喃香豆素和1个其他香豆素）均不存在于13批混淆品中。
　　结论：本研究首次建立了同一分析周期内同时鉴定和定量分析前胡中香豆素成分的UHPLC-Q-TOF-MS/MS法。该法简便、灵敏度高、专属性强。对前胡样品和前胡混淆品的分析可知角型吡喃香豆素是评价前胡质量的关键，且能用于区分前胡及其混淆品。
　　第二部分前胡质量标准研究
　　目的：建立前胡质量评价方法，为《欧洲药典》前胡质量标准的制订提供参考。
　　方法：以9批样品为分析对象，探索前胡质量评价方法。
　　1.鉴别：采用性状鉴别、显微鉴别和薄层色谱鉴别法。观察前胡的外观性状及其粉末在显微镜下的特征；薄层色谱鉴别法以甲醇作为提取溶剂，超声处理的方法制备样品，使用硅胶G薄层板，以环己烷-乙酸乙酯（2:1）为展开剂，紫外光灯（365 nm）下检视。
　　2.检查：依据《欧洲药典》中的检查方法对前胡进行水分、总灰分和酸不溶性灰分的检查。
　　3.含量测定：采用高效液相色谱法测定白花前胡甲素和白花前胡乙素两成分。以甲醇作为提取溶剂，超声处理时间为30分钟，提取液直接测定分析。采用Thermo ODS HYPERSIL色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），以甲醇-水（68:32）为流动相，流速0.8 mL/min，进样体积10μL，检测波长322 nm。
　　结果：
　　1.鉴别：前胡外观性状突出，具有特征性的纵沟、纵皱纹及横向皮孔样突起；前胡粉末显微特征突出，具有特征性的木栓细胞、导管和木纤维；薄层色谱法可见7个荧光斑点。
　　2.检查：9批样品的含水量均小于8.9%，总灰分均小于7.8%，酸不溶性灰分均小于3.4%。
　　3.含量测定：白花前胡甲素和白花前胡乙素分别在5.00~400.00μg/mL和0.50~40.00μg/mL范围内线性关系良好，回归方程分别为 Y=28.4782224X+6.484094（r=0.99999）和Y=25.5893187X-0.3288223（r=0.99999），精密度（RSD）均在0.6%~2.0%之间，加样回收率均在90.7%~104.8%之间。白花前胡甲素的含量范围为0.73%~2.24%，白花前胡乙素的含量范围为0.12%~0.33%。
　　结论：本文建立的鉴别、检查和含量测定方法稳定，更简便，可用于前胡的质量控制。
　　第三部分 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术区分呋喃香豆素类同分异构体及其在白芷中的应用
　　目的：建立一种快速、稳定的区分C-5位和C-8位不同取代的呋喃香豆素类同分异构体的质谱方法，并将其应用于白芷中呋喃香豆素类同分异构体的鉴定。
　　方法：采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术中的 MS-IDA-12MS/MS模式和子离子扫描模式对4对同分异构体，花椒毒素和佛手柑内酯、欧前胡素和异欧前胡素、补骨脂素和异补骨脂素、茴芹内酯和异茴芹内酯进行采集，使用 MasterView软件对其碎裂规律和碎片信息进行总结和分析，建立呋喃香豆素类同分异构体的质谱区分方法，并对白芷中的呋喃香豆素类同分异构体进行鉴定区分。采用Epic C18色谱柱（15 cm×2.1 mm，3μm），流动相为1 mmol/L乙酸铵水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脱。
　　结果：建立特征碎片离子的相对丰度比法（RRA）用于C-5位和C-8位不同取代的呋喃香豆素类同分异构体的区分。即呋喃香豆素类化合物易连续丢失CO产生碎片离子，根据同分异构体间主要碎片离子的相对丰度比值的大小区分取代基的位置。采用建立的方法共鉴定出白芷中5对呋喃香豆素类同分异构体。
　　结论：本方法基于呋喃香豆素的质谱裂解规律建立了稳定、快速的区分呋喃香豆素类同分异构体的质谱方法，并成功应用于中药复杂体系中此类同分异构体的区分。

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引言

第一部分前胡中香豆素类化合物同时鉴定和定量分析方法的建立及其在前胡与混淆品分析中的应用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分前胡质量标准研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术区分呋喃香豆素类同分异构体及其在白芷中的应用

前言

材料和方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:香豆素类化合物分析方法研究进展

致谢

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