二甲双胍对PCOS大鼠子宫内膜和卵巢IRS-1、IRS-2蛋白表达及酪氨酸磷酸化程度的影响

摘要

目的：多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种复杂的导致生殖功能障碍的内分泌失调性疾病，发病率占全球育龄女性5％～10％，主要表现为持续性不排卵，以高雄激素血症和高胰岛素血症为病理特征。Ovalle等人报道约50％～70％的PCOS患者，无论是否肥胖，均存在不同程度的探讨胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)，但其机制尚不清楚，在人体中很难进行对照研究。本研究旨在比较IRS-1、IRS-2蛋白表达及酪氨酸磷酸化程度在PCOS大鼠与正常大鼠的异同；研究二甲双胍对于PCOS大鼠子宫内膜和卵巢IRS-1、IRS-2的蛋白表达及酪氨酸磷酸化程度的影响；探讨二甲双胍改善PCOS大鼠子宫内膜和卵巢局部IR的发生机制，进而指导PCOS的临床治疗。
　　方法：
　　1实验动物及分组
　　1.1实验动物：85日龄左右(体重180±10g)健康清洁雌性SpraguDawley(SD)大鼠50只，购自河北医科大学动物中心，合格证编号：1111063。(见Fig.1)
　　1.2随机分组：空白对照组10只，模型对照组20只，二甲双胍组20只。
　　2实验方法
　　2.1动物模型制备：模型对照组和二甲双胍组采用Poretsky法建立PCOS大鼠模型，每日颈背皮下注射3 IU注射绒毛膜促性腺激素(humenchorionic gonadotrophich hormone，HCG)2次，第1天至第10天分别注射剂量递增的中效胰岛素，由0.5IU/天递增至6.0IU/天，以后每天固定剂量注射6.0IU，22天后检测大鼠血睾酮和胰岛素水平增高以及阴道涂片持续出现角化细胞者符合PCOS模型。空白对照组同期皮下注射生理盐水。
　　2.2药物干预实验：造模成功后每日分别给予空白对照组和模型对照组大鼠2ml蒸馏水灌胃，给予二甲双胍组大鼠二甲双胍3mg/kg(按大鼠与人体重系数折算剂量)灌胃，1天1次，22天后放血将各组大鼠处死。
　　3标本采集及测定
　　3.1标本采集：抽取大鼠心脏血，分离血清，采用化学发光免疫法测定血清激素水平；打开大鼠腹腔，观察双侧卵巢和子宫的大体形态，分别测量三组大鼠卵巢湿重，取卵巢和子宫组织以10％多聚甲醛固定，石蜡包埋。(见Fig.2、Fig.3、Fig.4)
　　3.2标本测定：光学显微镜观察HE染色子宫内膜及卵巢大体形态变化；免疫组织化学染色检测IRS-1和IRS-2在子宫内膜及卵巢的定位表达及酪氨酸磷酸化程度。
　　结果：
　　模型对照组和二甲双胍组大鼠在采用Poretsky法造模22天后检测血睾酮和胰岛素水平增高以及阴道涂片持续出现角化细胞者为造模成功的PCOS大鼠，共计33只，造模成功率为82.5％。
　　1激素水平的变化
　　模型对照组T和INS水平较空白对照组明显增高(P＜0.01)，二甲双胍组INS水平与模型对照组相比显著降低(P＜0.01)，但仍高于空白对照组水平(P＜0.01)。二甲双胍组T水平与模型对照组相比有所下降(P＜0.05)，但仍高于空白对照组水平(P＜0.01)。(见Table1)
　　2卵巢湿重变化
　　经电子天平测定，三组大鼠卵巢湿重分别为：空白对照组(0.0258±0.0017)g，模型对照组(0.1306±0.0094)g，二甲双胍组(0.0641±0.0083)g。模型对照组大鼠卵巢湿重与空白对照组相比明显增加(P＜0.01)，二甲双胍组大鼠卵巢湿重模型对照组相比明显降低(P＜0.01)。(见Table2)
　　3卵巢的形态学变化
　　空白对照组大鼠卵巢色泽红，可见黄体；镜下可见多个黄体及不同发育阶段的各级卵泡，其中优势卵泡可见8～9层颗粒细胞。模型对照组卵巢为淡红色，体积增大，极少见黄体形成；镜下可见卵泡囊性扩张，未见卵母细胞及放射冠等基本结构，仅见1～2层颗粒细胞及大量闭锁卵泡。二甲双胍组卵巢色泽红，可见黄体；镜下可见各级卵泡及多个黄体形成，少见或未见囊性扩张卵泡，优势卵泡内可见卵冠丘、卵泡液，颗粒细胞层数明显增多。(见Fig.5)
　　4子宫内膜的形态学变化
　　空白对照组大鼠子宫色泽鲜润；镜下可见子宫内膜腺体数量较多，腺腔大而多褶，呈簇状排列，腺上皮中可见分泌泡。模型对照组子宫略显充盈；镜下可见子宫内膜腺体数目明显减少，腺腔小而直，排列较分散。二甲双胍组子宫色泽较鲜润；镜下可见子宫内膜腺体数目增多，腺腔多小而直，部分可见到皱褶和分支，出现簇状排列。(见Fig.6)
　　5免疫组织化学染色结果
　　三组大鼠卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞和子宫内膜腺上皮细胞均见IRS-1、IRS-2及酪氨酸磷酸化的表达，呈黄色颗粒状。但具体表达强度明显不同，结果如下：
　　5.1子宫内膜组织IRS-1蛋白表达：空白对照组、模型对照组和二甲双胍组IRS-1灰度值分别为(68.96±12.73)、(139.66±3.04)和(80.46±7.68)，IRS-1在模型对照组子宫内膜腺上皮表达水平明显低于空白对照组水平(P＜0.01)，二甲双胍组IRS-1表达较模型对照组显著增高(P＜0.01)，但仍低于空白对照组(P＜0.05)。(见Fig.7、Table3)
　　5.2子宫内膜组织IRS-2蛋白表达：空白对照组、模型对照组和二甲双胍组IRS-2灰度值分别为(98.80±1.59)、(123.33±5.62)和(104.71±8.97)，IRS-2在模型对照组子宫内膜腺上皮表达水平明显低于空白对照组水平(P＜0.01)，二甲双胍组IRS-2表达较模型对照组显著增高(P＜0.01)，但仍低于空白对照组(P＜0.05)。(见Fig.8、Table3)
　　5.3子宫内膜组织酪氨酸磷酸化程度比较：P-tyr(IRS-1)在空白对照组、模型对照组和二甲双胍组灰度值分别为(75.64±4.67)、(125.16±22.35)和(97.44±9.11)，P-tyr(IRS-1)在模型对照组子宫内膜腺上皮表达水平明显低于空白对照组水平(P＜0.01)，二甲双胍组P-tyr(IRS-1)表达较模型对照组显著增高(P＜0.01)，但仍低于空白对照组(P＜0.05)；P-tyr(IRS-2)在空白对照组、模型对照组和二甲双胍组灰度值分别为(68.10±8.36)、(131.75±10.41)和(102.86±3.77)，P-tyr(IRS-2)在模型对照组子宫内膜腺上皮表达水平明显低于空白对照组水平(P＜0.01)，二甲双胍组P-tyr(IRS-2)表达较模型对照组显著增高(P＜0.01)，但仍低于空白对照组(P＜0.05)。(见Fig.9、Table3)
　　5.4卵巢组织IRS-1蛋白表达：空白对照组、模型对照组和二甲双胍组IRS-1灰度值分别为(102.63±3.59)、(54.07±13.33)和(89.42±7.20)，模型对照组大鼠卵巢IRS-1表达较空白对照组升高(P＜0.01)，二甲双胍组卵巢IRS-1蛋白表达较模型对照组明显降低(P＜0.01)，但仍高于空白对照组(P＜0.05)。(见Fig.10、Table4)
　　5.5卵巢组织IRS-2蛋白表达：空白对照组、模型对照组和二甲双胍组IRS-2灰度值分别为(98.42±4.57)、(103.16±10.83)和(105.29±9.65)，经统计学分析IRS-2蛋白表达水平在三组无明显变化。(见Fig.11、Table4)
　　5.6卵巢组织酪氨酸磷酸化程度比较：P-tyr(IRS-1)在空白对照组、模型对照组和二甲双胍组灰度值分别为(97.46±2.61)、(136.39±17.71)和(112.15±8.94)，模型对照组卵巢内P-tyr(IRS-1)显著低于空白对照组水平(P＜0.01)，二甲双胍组P-tyr(IRS-1)表达较模型对照组显著增高(P＜0.01)；P-tyr(IRS-2)在空白对照组、模型对照组和二甲双胍组灰度值分别为(104.90±6.35)、(154.78±21.06)和(123.31±4.76)，模型对照组卵巢内P-tyr(IRS-2)显著低于空白对照组水平(P＜0.01)，二甲双胍组P-tyr(IRS-2)表达较模型对照组显著增高(P＜0.01)。(见Fig.12、Table4)
　　结论：
　　PCOS大鼠子宫内膜和卵巢局部可能存在胰岛素抵抗，其原因可能与IRS-1和IRS-2蛋白表达及酪氨酸磷酸化异常有关；二甲双胍可能通过调整IRS-1和IRS-2蛋白表达水平，提高IRS-1和IRS-2酪氨酸磷酸化程度，增加了胰岛素敏感性，进而改善了PCOS大鼠子宫内膜和卵巢局部的胰岛素抵抗状态。