莱菔硫烷对Ⅱ相酶的诱导及其与核转录因子Nrf1、Nrf2、Nrf3关系的研究

摘要

氧化应激在许多疾病的病因学中占有重要地位，机体产生有效的反应来对抗内源性或外源性氧化剂带来的一系列威胁，这对于维持细胞内环境稳态和生存至关重要。在中枢神经系统，转录因子核因子红系2相关因子2(Nrf2)在星形胶质细胞介导的保护神经元、对抗氧化应激反应中起着举足轻重的作用。Nrf2促进含抗氧化反应元件(ARE)启动子序列的抗氧化基因的转录，这些基因包括谷氨酸半胱氨酸连接酶催化和调节亚单位(Gclc、Gclm)，谷胱甘肽转移酶同工酶类(GST)，NAD(P)H：醌氧化还原酶1(Nqol)，血红素氧化酶1(Hol)。Nrf2属于CNC(cap'n'collar)碱性亮氨酸拉链结构(bZIP)家族的转录因子，CNC家族还包括Nrfl和Nrf3。Nrf1和Nrf2正向调节ARE介导的基因表达，而c-Fos和Fra1负向调节这一表达过程。莱菔硫烷(sulforaphane，SFN)自1992年被发现具有化学保护作用以来，逐渐成为国内外研究的热点。SFN具有抗肿瘤、抗氧化损伤、免疫调节、抗菌等药理作用，SFN通过分裂Nrf2-Keap1之间的连接诱导Ⅱ相酶，McWalter等用SFN喂养Nrf2敲除小鼠7d后仍然在胃、小肠、肝脏中发现Nqol、GSTA1/2、GSTA3和GSTM1/2表达增加，虽不能与正常组比较，但说明可能还有另外的机制在起作用。有人认为Nrf3负相调节ARE介导的基因表达，具有一定的生理功能。因此，本实验欲利用莱菔硫烷干预Nrf2+/+，Nrf2-/-小鼠培养的原代星形胶质细胞模型探讨Ⅱ相酶诱导与核转录因子Nrf1、Nrf2、Nrf3之间的关系。
　　第一部分原代星形胶质细胞模型的建立
　　目的：体外培养小鼠原代星形胶质细胞。
　　方法：
　　1原代星形胶质细胞培养：将Nrf2+/+、Nrf2-/-新生乳鼠消毒、断头，取出大脑皮层，放于D-Hank's液中，解剖显微镜下剥离脑膜。将组织剪碎，胰蛋白酶消化，终止后离心，弃去上清液，重悬后将细胞悬液接种至25cm2玻璃培养瓶底，放于37℃，5％CO2培养箱中培养。24-36小时后换液，以后每4-5天换液一次，倒置荧光显微镜下观察细胞生长状况。
　　2原代星形胶质细胞的纯化及鉴定：将90％以上融合的星形胶质细胞培养瓶置于恒温培养摇床，37℃，200转/分钟，连续摇动3小时后更换培养液，放入CO2培养箱中。用胰酶消化后，接种于24孔细胞培养板中，待细胞长满后取出，多聚甲醛固定，打孔，马血清封闭；加入抗GFAP小鼠单克隆抗体，4℃摇床过夜。次日避光加入CY5标记的抗小鼠荧光二抗和Hochest染料，捞出小玻片用抗荧光衰减封片剂封片，激光共聚焦显微镜观察，照相。
　　结果：细胞的生长情况及鉴定：大脑皮层细胞培养约4-6小时后贴壁生长，为圆点状带有突起。24-48小时后细胞变大，突起变长，有少数细胞相互融合成片状。12-14天后细胞约占95％以上，分为两层，底层为片状彼此融合的星形胶质细胞，细胞体积较大，胞质丰富，核偏位，突起较多较长，相互交联呈网状结构，细胞彼此界限不明显，上层为亮点状小胶质细胞，细胞体积小，胞质含量少，突起细长，细胞间界限明显。经摇床，纯化后，可见上层细胞脱落，细胞种类更为单一。星形胶质细胞的标记物GFAP染色，95％以上为阳性细胞。
　　结论：培养出的细胞为原代星形胶质细胞，纯度达95％以上，该细胞可用于体外Ⅱ相酶诱导与核转录因子Nrf2依赖关系的研究。
　　第二部分莱菔硫烷对Ⅱ相酶的诱导及其与核转录因子Nrf1、Nrf2、Nrf3关系的研究
　　目的：观察莱菔硫烷对原代培养的星形胶质细胞Ⅱ相酶诱导情况，以及Ⅱ相酶诱导与核转录因子Nrf1、Nrf2、Nrf3的关系。
　　方法：
　　1 Nrf2+/+、Nrf2-/-转基因小鼠的鉴定：提取Nrf2+/+、Nrf2-/-小鼠尾尖DNA，分别以Nrf2+/+、Nrf2-/-引物PCR扩增目的基因，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。
　　2实验分组及收集细胞：细胞分为两组，即Nrf2+/+和Nrf2-/-组，每组又分为溶剂对照组和药物干预组。首先给予Nrf2+/+组不同浓度的莱菔硫烷，即DMSO、2.5umol/1、5umol/1、10umol/1、15umol/1，通过测定Ⅱ相酶的表达来选择最佳给药浓度。然后分别给予Nrf2+/+、Nrf2-/-组DMSO和最适浓度的莱菔硫烷，24小时后弃去培养液，收集细胞，储存于-80℃冰箱。
　　3Ⅱ相酶表达水平测定：用裂解液裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度，每个样品按20μg蛋白上样，10％SDS-PAGE电泳后转膜至PVDF膜，封闭后经兔抗Gclc抗体(1:500)、兔抗Hol抗体(1:500)、兔抗Gclm抗体(1:200)、羊抗Nqol抗体(1:3000)或鼠抗Actin抗体(1:500)孵育，4℃摇床过夜。次日，洗膜后分别加入抗兔、抗羊或抗小鼠荧光二抗(1:10000)室温孵育，Odyssey红外成像系统扫膜，分析结果。
　　4 Nrf1、Nrf3的mRNA水平测定：取出Nrf2+/+、Nrf2-/-组药物干预及对照组细胞，使用EasyPure RNA Kit试剂盒提取RNA，测定RNA浓度，梯度PCR仪反转录为cDNA；分别加入Nrf1、Nrf3及GAPDH的上下游引物、TransStartGreenqPCR SuperMix、cDNA、Passive Reference Dye，建立扩增体系，荧光定量PCR仪测定目的基因含量。
　　5统计学处理：采用SPSS13.0软件进行统计学处理，统计方法为单因素方差分析和秩和检验。测定结果以均数±标准差(x-±s)表示，采用检验水准α=0.05，P<0.05有统计学意义。
　　结果：
　　1小鼠基因组DNA的Nrf2基因PCR产物电泳结果示：700bp条带阳性为Nrf2+/+小鼠；400bp条带阳性为Nrf2-/-小鼠。
　　2不同浓度莱菔硫烷干预Nrf2+/+星形胶质细胞示，10μmol/1对Ⅱ相酶Gclm、Nqol、Hol蛋白表达的诱导作用最强，因此认为10μmol/1为最佳给药浓度。
　　3 Gss在Nrf2+/+和Nrf2-/-细胞中基础表达有明显差异，而Hol、Nqol、Gclc、Gclm则没有差异。Nrf2+/+和Nrf2-/-细胞分别给予莱菔硫烷处理后，Hol均能明显上调。Nqol和Gclm只在Nrf2+/+细胞中明显上调，在Nrf2-/-细胞中不上调。而对于Gss和Gclc，给药后Nrf2+/+和Nrf2-/-细胞两种酶表达均无明显变化。
　　4 Nrf1、Nrf3mRNA表达变化：在Nrf2+/+细胞，莱菔硫烷干预后Nrf1、Nrf3mRNA均下降，与未干预组比较有统计学意义；但是在Nrf2-/-细胞，莱菔硫烷干预后Nrf1和Nrf3mRNA均有下调，但与未干预组比较均无统计学意义。但Nrf3mRNA在Nrf2-/-给药组明显高于Nrf2+/+细胞给药组，而Nrf1mRNA在Nrf2-/-与Nrf2+/+给药组间无显著差别。
　　结论：
　　1原代培养的星形胶质细胞纯度高，可用于体外研究Ⅱ相酶诱导通路。
　　210μmol/1莱菔硫烷对原代培养的星形胶质细胞Hol的诱导不完全依赖于核转录因子Nrf2；对Nqol、Gclm的诱导很大程度上依赖于转录因子Nrf2；对Gss和Gclc的表达无明显诱导作用。
　　3在原代培养的星形胶质细胞中，Nrf2存在情况下，Nrf2-ARE通路激活剂莱菔硫烷上调Ⅱ相酶时，转录因子Nrf1、Nrf3 mRNA表达均受抑制；Nrf2敲除情况下，给予Ⅱ相酶诱导剂，Nrf3可能在上调Ⅱ相酶过程中起一定代偿作用。