肝癌患者血浆RASSF1A,APC基因甲基化检测的临床应用价值

摘要

目的：抑癌基因RASSF1A和APC基因分别是Ras和Wnt两个信号途径中的分子，以往已有一些研究证实在原发性肝癌(以下简称肝癌)组织中可检测到这两个基因的异常甲基化，但研究结论尚不一致。大多关于抑癌基因RASSF1A、APC启动子区域的DNA甲基化检测多采用新鲜组织，但组织标本不适宜肝癌的筛选及早期检测，相较而言血浆标本比较容易获得。一些研究已经证明在肿瘤组织与配对血浆样本中DNA甲基化的改变有很高的一致性，表明血浆中DNA甲基化检测作为肿瘤标记物有潜在效用。本研究采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specificPCR，MSP)的检测方法，检测肝癌、肝硬化患者及健康人血浆中抑癌基因RASSF1A、APC的甲基化状态，研究其诊断价值，并分析其与临床资料及生存期预后的关系，为研究用于肝癌筛查、临床诊断及预后判断的血清学标记物提供更多依据。
　　方法：
　　1研究对象：2007年5月至2011年9月于河北医科大学第四医院消化内科住院的肝癌患者102例，肝硬化患者80例及健康人100例作为对照。102例肝癌患者中，男性82例，女性20例，年龄在29～84岁，平均年龄为56.62±10.66岁，80例肝硬化患者中，男性患者57例，女性患者23例，年龄在23～78岁，平均年龄为58.68±10.28岁。依据国内临床诊断及分期标准(广州，2001)对肝癌进行临床诊断与分期，肝癌患者Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期的例数分别为8例、41例和53例。收集所有患者临床资料，通过电话联系对肝癌患者进行随访。
　　2抑癌基因启动子区域的甲基化检测方法：
　　将经EDTA抗凝的全血2500rpm离心2分钟后取上清液得到血浆标本，用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取血浆DNA，经亚硫酸盐处理后，用Wizard DNA纯化纯化试剂盒纯化血浆DNA，具体步骤按试剂盒说明书进行，采用甲基化特异性PCR的方法(MSP法)。PCR扩增引物的序列：RASSF1A基因甲基化的引物序列为：上游引物5’-GGGTTTTGCGAGAGCGCG-3'，下游引物5'-GATAACAAACGCGAACCG-3'，非甲基化的引物序列为：上游引物5'-GGGGTTTTGTGAGAGTGTG-3'，下游引物5'-ACTAACAAACACAAACCAAAC-3'；APC基因甲基化的引物序列为：上游引物5’-TATTGCGGAGTGCGGTC-3’，下游引物5'-TCGACGAACTCCCGACGA-3’，非甲基化的引物序列为：上游引物：5'-GTGTTTTATTGTGGAGTGGGTT-3'，下游引物5'-CCAATCAACAAACTCCCAACAA-3'。对抑癌基因RASSF1A，APC进行目的片段的扩增，扩增反应体系为2×HSTMTaqMix Kit，扩增产物通过电泳凝胶成像系统进行甲基化结果分析判定。
　　3统计学分析：所有数据均使用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，P＜0.05认为有统计学意义。
　　结果：
　　1肝癌、肝硬化及健康人血浆中RASSF1A、APC基因甲基化状态及比较
　　RASSF1A基因启动子区甲基化阳性率在肝癌和肝硬化血浆中分别为51.96％(53/102)和15％(12/80)，健康人血浆中未发现甲基化0％(0/100)，三组的甲基化阳性率的差异有统计学意义(X2=80.944，P=0.000＜0.05)。对肝癌组及肝硬化组血浆甲基化进行比较，差异有统计学意义(X2=26.677，P=0.000)。健康人组分别与肝癌组及肝硬化组血浆甲基化进行比较，差异均有统计学意义(P=0.000，P=0.000)。
　　APC基因启动子区甲基化阳性率在肝癌和肝硬化血浆中分别为47.05％(48/102)和22.5％(18/80)，健康人血浆中未发现甲基化0％(0/100)，三组的甲基化阳性率的差异有统计学意义(X2=62.429，P=0.000＜0.05)，对肝癌组及肝硬化组APC基因甲基化进行比较，差异有统计学意义(X2=11.700，P=0.001)。健康人组分别与肝癌组及肝硬化组血浆甲基化进行比较，差异均有统计学意义(P=0.000，P=0.000)。
　　2肝癌血浆中RASSF1A，APC基因甲基化状态与临床资料的比较
　　RASSF1A和APC基因甲基化状态与患者的年龄、性别、Child-pugh分级、AFP值大小无关，RASSF1A基因甲基化与肿瘤个数、是否伴有肝硬化、有无门静脉瘤栓及临床分期相关。RASSF1A基因甲基化阳性率在肿瘤多发和肿瘤单发肝癌血浆中分别为60％和36.54％，P=0.018，在伴有肝硬化和不伴有肝硬化中分别56.18％和23.08％，P=0.026，在有门静脉瘤栓和无门静脉瘤栓中分别为67.65％和38.24％，P=0.005，在临床分期Ⅲ期和临床分期(Ⅰ+Ⅱ)期中分别为62.26％和40.82％，P=0.030。APC基因甲基化状态与HBsAg是否呈阳性及有无门静脉瘤栓相关。APC基因的甲基化阳性率在HBsAg呈阳性和HBsAg呈阴性的肝癌患者血浆中分别为55.81％和31.25％，P=0.003，在有门静脉瘤栓组和无门静脉瘤栓组分别为64.71％和38.24％，P=0.012。
　　以AFP≥400ug/L认为AFP检测阳性，AFP＜400ug/L认为AFP检测阴性。102例肝癌患者中AFP检测的阳性率为43.14％(44/102)，在58例AFP阴性的患者中，31例发生了RASSF1A基因甲基化，占53.4％，27例发生了APC基因甲基化，占46.5％。
　　3肝癌血浆中两种抑癌基因RASSF1A，APC甲基化状态的相互关系
　　102例肝癌患者中，两种抑癌基因均未发生甲基化的占29.41％(30/102)，至少有一个基因发生甲基化的占70.59％(72/102)，同时存在两个基因甲基化的占28.43％(29/102)。采用Pearson相关分析肝癌血浆中RASSF1A，APC基因甲基化状态的关联程度，发现两中抑癌基因甲基化状态不存在相关关系。
　　4血浆RASSF1A，APC基因甲基化检测对肝癌的诊断价值
　　在肝癌、肝硬化及健康人三组共282例血浆标本中，RASSF1A基因甲基化对肝癌诊断的灵敏度为52％，特异度为93.3％，APC基因甲基化对肝癌诊断的灵敏度为47.1％，特异度为90％，联合RASSF1A及APC基因甲基化检测对肝癌诊断的灵敏度为70.6％，特异度为86.7％。
　　5肝癌血浆RASSF1A，APC基因甲基化状态与生存期预后的关系
　　RASSF1A基因甲基化阳性组的平均生存期为(15.28±2.85)个月，RASSF1A基因甲基化阴性组的平均生存期为(25.86±3.77)，两组生存率比较，差异有统计学意义(P=0.011＜0.05)。
　　APC基因甲基化阳性组的平均生存期为(17.16±2.81)个月，APC基因甲基化阴性组的平均生存期为(24.69±3.91)，两组生存率比较，差异无统计学意义(P=0.175＞0.05)。
　　RASSF1A或APC基因至少有一种基因甲基化状态阳性的为72例，平均生存期为(10.80±2.59)个月，两种基因甲基化状态均阴性的为29例，平均生存期为(23.63±4.91)，两组生存率比较，差异有统计学意义(P=0.019＜0.05)。
　　进一步COX多因素分析结果提示，AFP、临床分期、治疗方式及门静脉瘤栓有无为独立预后因子，RASSF1A和APC基因甲基化状态不能作为肝癌的独立预后因子，但联合检测RASSF1A和APC基因甲基化状态，其中至少一个基因甲基化状态阳性患者，基因甲基化状态检测结果可以作为评价生存期预后的独立预后因子(P=0.019＜0.05)。
　　结论：
　　1肝癌组血浆甲基化阳性率显著高于肝硬化组及健康人组，说明RASSF1A，APC基因甲基化在肝癌形成中可能起一定作用。
　　2血浆RASSF1A，APC基因甲基化状态检测对筛查AFP阴性肝癌有意义，且两种基因甲基化状态与肝癌患者有无门静脉瘤栓组相关，RASSF1A基因甲基化状态与患者临床分期分期相关，说明血浆RASSF1A，APC基因甲基化状态可以反映肝癌患者病情与预后。
　　3联合检测RASSF1A和APC基因甲基化状态可以作为评价肝癌生存期预后的独立预后因子。