高表达HSP70的肿瘤细胞裂解液对结肠癌小鼠抗肿瘤机制研究

摘要

目的：热休克蛋白与免疫治疗的关系成为近年来的研究热点之一。早期的研究发现，肿瘤细胞裂解液具有减慢荷瘤小鼠肿瘤细胞生长的作用。本实验利用热处理可以增加肿瘤细胞HSP表达，进而增强肿瘤细胞裂解液免疫原性的特点，制备高表达HSP70的肿瘤细胞裂解液做为特异性肿瘤细胞疫苗，研究该疫苗对结肠癌荷瘤小鼠的免疫治疗作用，并探讨其抗肿瘤作用机制。
　　方法：⑴肿瘤细胞裂解液的制备将小鼠结肠癌细胞株C26经42℃热处理1h后，再分别经37℃孵育8h和12h，与未经热处理仅经37℃孵育的C26细胞，分别反复冻融法(液氮与37℃水浴反复冻融五次)分别将其制备成肿瘤细胞裂解液。⑵高表达HSP70的肿瘤细胞裂解液的筛选用光学显微镜观察上述经不同处理的三组C26细胞的形态变化，用激光共聚焦显微镜观察和Western-blot法检测HSP70的含量，筛选出高表达HSP70的肿瘤细胞裂解液。⑶建立荷瘤动物模型将C26细胞接种于小鼠右侧背部皮下，待其成瘤后，将经热处理的瘤细胞裂解液、未经热处理的瘤细胞裂解液以1×106/只/次，多次接种于小鼠同侧背部皮下，同时将接种PBS组做为阴性对照组，并观察热处理的肿瘤细胞裂解液、未经热处理的肿瘤细胞裂解液与PBS对小鼠体内成瘤性、生长情况及小鼠生存期的影响。⑷脾细胞免疫功能的检测接种C26细胞6周后分别取三组小鼠的脾细胞，用乳酸脱氢酶法、MTS法分别检测三组小鼠脾细胞CTL杀伤活性、脾细胞增殖反应情况。用流式细胞技术检测接种热处理的肿瘤细胞裂解液、未经热处理的肿瘤细胞裂解液和PBS的小鼠脾细胞表面分子CD3+、CD4+和CD8+T等细胞功能的变化。⑸荷瘤小鼠血清中细胞因子含量分析用ELISA法检测接种热处理的肿瘤细胞裂解液、未经热处理的肿瘤细胞裂解液和接种PBS的荷瘤小鼠血清中TGF-β1和IFN-γ，水平的变化。
　　结果：①经热处理用反复冻融法制备的高表达HSP70的肿瘤细胞裂解液。光镜下观察，42℃水浴1h、37℃孵育12h的肿瘤细胞、42℃水浴1h、37℃孵育8h的肿瘤细胞和未经42℃水浴仅经37℃孵育的肿瘤细胞形态学并无明显变化，激光共聚焦显微镜和Western-blot分析结果证明，三组细胞中均有HSP70蛋白表达，其中，42℃水浴1h、37℃孵育12h的肿瘤细胞裂解液中HSP70蛋白表达水平最高；42℃水浴1h、37℃孵育8h的肿瘤细胞裂解液蛋白表达水平次之，未经42℃水浴仅经37℃孵育的肿瘤细胞裂解液蛋白表达水平最低。②将高表达HSP70的肿瘤细胞裂解液接种于荷瘤小鼠后，小鼠的肿瘤生长速度、肿瘤体积和重量明显小于未经热处理的对照组及PBS组，生存期也明显延长(P<0.05)。③将接种经热处理高表达HSP70的肿瘤细胞裂解液后，小鼠脾细胞在体外经MMC-C26细胞诱导，CTL对C26细胞的杀伤能力明显高于接种未经热处理的肿瘤细胞裂解液和接种PBS组小鼠的脾细胞(P<0.01)。④与未经热处理的肿瘤细胞裂解液和PBS组相比，高表达HSP70的肿瘤细胞裂解液对小鼠脾细胞的增殖反应明显增强(P<0.05)。⑤皮下接种高表达HSP70的肿瘤细胞裂解液组小鼠肿脾细胞表面分子CD8+表达水平与接种未经42℃水浴仅经37℃孵育的肿瘤细胞裂解液组和接种PBS组小鼠相比显著增高(P<0.05)，而CD3+和CD4+/CD8+T细胞与之相比显著降低(P<0.05)。⑥皮下接种高表达HSP70的肿瘤细胞裂解液组的小鼠血浆，TGF-β1含量与接种未经42℃水浴仅经37℃孵育的瘤细胞裂解液组和接种PBS组小鼠相比显著降低(P<0.05)，但IFN-γ，在小鼠血浆中的含量则显著升高(P<0.05)。
　　结论：经热刺激的瘤细胞裂解液免疫小鼠的肿瘤体积明显减小，生存期明显延长，证明该瘤细胞裂解液在小鼠体内有明显的抗肿瘤作用。其抗肿瘤机制与促进抑制肿瘤细胞生长的细胞因子(IFN-γ)的释放，抑制促进肿瘤生长的细胞因子(TGF-β1)的释放，促进脾细胞增殖，促进抑制肿瘤生长的细胞分子的表达，增强CTL杀伤活性等一系列增强机体的免疫应答有关。