肿瘤抗原MAGE-A11在乳腺癌组织中的表达及对雌激素依赖型乳癌细胞增殖的影响

摘要

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。目前，乳腺癌的治疗仍然以手术治疗为主，辅以放疗、化疗和内分泌治疗。由于乳腺癌是一种异质性的疾病，到目前为止还没有一个适用于所有类型乳腺癌的治疗金标准。因此，其总的治疗效果仍不十分理想。
　　目前肿瘤免疫治疗已经成为继手术、放疗和化疗后的第四种肿瘤治疗模式，并具有创伤小和针对性强的特点，尤其对一些手术疗效不佳的肿瘤不失为一种好的选择。而鉴定合适的靶抗原是抗原特异性肿瘤免疫治疗的第一步，也是最关键的一步。肿瘤抗原成为肿瘤免疫治疗靶点的前提条件是，其在肿瘤组织中必须高表达，且在正常组织中的无表达或其表达必须具有高度限制性，以避免在肿瘤治疗的过程中发生自身免疫性疾病。
　　近年来，癌睾丸抗原(cancer/testis antigen，CTA)因其特异性的表达模式而成为了肿瘤免疫治疗的理想靶点。其在各种肿瘤组织中广泛表达，而在正常组织中仅限于在睾丸生殖细胞中表达，偶在胎盘中表达，而睾丸是免疫豁免器官，不表达人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)分子，不引起机体特异性的免疫反应。因此CTA适于作为特异性肿瘤免疫治疗的靶抗原。作为CTA亚家族的黑色素瘤抗原基因(Melanoma-associated antigen gene，MAGE)是从黑色素瘤细胞中分离出来的一大家族抗原基因。
　　导师所在课题组近年来一直在致力于MAGE家族的生物学功能及作为肿瘤特异性免疫治疗靶分子可能性的研究。根据MAGE的表达模式不同，将MAGE家族分为两个不同的亚类，即MAGE-Ⅰ类抗原和MAGE-Ⅱ类抗原。其中MAGE-Ⅰ类抗原为肿瘤特异性抗原，MAGE-Ⅱ类抗原在正常的成人体细胞中均普遍表达，因此不属于CTA的范畴。MAGE-Ⅰ类抗原又分为三个亚类，即MAGE-A、MAGE-B和MAGE-C。其中MAGE-A包括12个成员，即MAGE-A1-MAGE-A12。目前关于MAGE-A11在乳腺癌中的表达及在乳腺癌发生发展中的功能的研究还很少。
　　本研究首先采用免疫组织化学方法从蛋白水平上研究了MAGE-A10和MAGE-A11在乳腺癌组织及相应乳腺正常组织中的表达状况及与乳腺癌临床生物学指标以及预后之间的关系。通过构建MAGE-A11表达载体、基因转染、RT-PCR、Western-blot及免疫共沉淀等研究方法研究了外源性MAGE-A11对雌激素依赖型乳腺癌细胞增殖的影响及作用机制。
　　主要研究内容和结果如下：
　　第一部分肿瘤抗原MAGE-A10和MAGE-A11在乳腺癌组织中的表达及与乳腺癌临床病理学指标和预后的关系
　　目的：通过检测MAGE-A10和MAGE-A11在乳腺癌组织和相应乳腺正常组织中的表达，探讨两者的蛋白表达与乳腺癌临床病理学指标及预后之间的关系。
　　方法：采用免疫组织化学方法从蛋白水平上检测MAGE-A10和MAGE-A11在75例乳腺癌组织及相应乳腺正常组织中的表达，并回顾性分析两者的表达与乳腺癌临床病理学指标(包括患者年龄、病理类型、组织学分级、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移状况、雌激素受体(Estrogenreceptor，ER)、孕激素受体(Progestrogen receptor，PR)及HER-2表达的关系。通过病例随访，比较两者表达与乳腺癌患者生存率之间的关系。
　　结果：
　　1 MAGE-A10和MAGE-A11在正常睾丸组织中的表达
　　选取正常睾丸组织作为MAGE-A10和MAGE-A11表达的阳性对照。在正常睾丸组织中，MAGE-A10和MAGE-A11均主要在初级精母细胞和精原细胞中表达，其阳性产物主要定位于细胞质，部分定位于细胞核。
　　2 MAGE-A10和MAGE-A11在乳腺癌和乳腺正常组织中的表达
　　免疫组织化学染色的结果显示，MAGE-A10在乳腺癌中的免疫组织化学染色阳性产物均主要定位于细胞质，部分定位于细胞核。75例乳腺正常组织中没有发现MAGE-A10蛋白的表达，75例乳腺癌组织有55例MAGE-A10蛋白表达阳性，阳性率为73.3％，明显高于乳腺正常组织中的表达(P<0.05)。以上结果提示，MAGE-A10是一种肿瘤特异性抗原。
　　免疫组织化学染色的结果显示，MAGE-A11在乳腺癌中的免疫组织化学染色阳性产物主要定位于细胞质，部分定位于细胞核。75例乳腺正常组织中没有发现MAGE-A11蛋白的表达，75例乳腺癌组织有39例MAGE-A11蛋白表达阳性，阳性率为52.0%，明显高于乳腺正常组织中的表达(P<0.05)。以上结果提示，MAGE-A11是一种肿瘤特异性抗原。
　　3 MAGE-A10和MAGE-A11蛋白表达与乳腺癌临床病理特征之间的关系
　　统计学分析结果显示，MAGE-A10蛋白表达与乳腺癌患者的年龄(χ2=1.003，P=0.606)、病理类型(χ2=2.327，P=0.127)、组织学分级(χ2=0.645，P=0.724)、临床分期(χ2=1.364，P=0.506)、肿瘤大小(χ2=0.642，P=0.725)、淋巴转移(χ2=0.052，P=0.820)、ER(χ2=1.847，P=0.174)及PR表达(χ2=0.487，P=0.485)均无相关性。
　　MAGE-A11蛋白表达与乳腺癌患者的年龄(χ2=0.542，P=0.763)、病理类型(χ2=0.033，P=0.855)、组织学分级(χ2=0.739，P=0.691)、临床分期(χ2=0.666，P=0.717)、肿瘤大小(χ2=2.350，P=0.309)、淋巴转移(χ2=2.376，P=0.123)、PR表达(χ2=0.153，P=0.696)均无相关性(P>0.05)，但与ER的表达呈正相关。36例ER表达阳性的乳腺癌患者中有25例MAGE-A11蛋白的表达阳性(69.4%)，39例ER表达阴性的乳腺癌患者中有14例MAGE-A11蛋白的表达阳性(35.9%)，两者之间有统计学差异(χ2=8.441，P=0.004)。
　　4 MAGE-A10和MAGE-A11蛋白表达与HER-2表达之间的关系
　　免疫组织化学染色的结果显示，HER-2在乳腺癌中的免疫组织化学染色阳性产物主要定位于细胞膜。统计学分析结果显示，75例乳腺癌患者中有7例HER-2表达为(-)(9.3%)，29例HER-2表达为(+)(38.7%)，18例HER-2表达为(++)(24%)，21例HER-2表达(++)(28%)。
　　统计学分析结果显示，MAGE-A10的表达与HER-2表达无相关性(χ2=1.563，P=0.663)。HER-2表达阳性的乳腺癌患者中MAGE-A11蛋白的表达率明显高于HER-2表达阴性的乳腺癌患者(χ2=14.029，P=0.003)。
　　5 MAGE-A10和MAGE-A11蛋白表达与乳腺癌患者的生存率之间的关系
　　统计学分析结果显示，MAGE-A10表达阳性的乳腺癌患者的生存率与MAGE-A10表达阴性的乳腺癌患者相比无明显差异(P=0.881)。MAGE-A11表达阳性的乳腺癌患者的生存率与MAGE-A11表达阴性的乳腺癌患者相比明显降低(P=0.030)。提示，MAGE-A11蛋白表达有可能是乳腺癌患者预后不良的一个重要标记。
　　结论：
　　1乳腺正常组织不表达MAGE-A10和MAGE-A11的蛋白。MAGE-A10和MAGE-A11在乳腺癌组织中的表达率分别为73.3%和52.0%。提示MAGE-A10和MAGE-A11是肿瘤特异性抗原。
　　2 MAGE-A10蛋白表达与乳腺癌患者的年龄、病理类型、组织学分级、临床分期、肿瘤大小、淋巴转移、ER及PR表达状态均无相关性。
　　3 MAGE-A11蛋白表达与乳腺癌患者的年龄、病理类型、组织学分级、临床分期、肿瘤大小、淋巴转移、PR表达均无相关性，但与ER的表达呈正相关。ER表达阳性的乳腺癌患者中MAGE-A11蛋白的表达率明显高于ER表达阴性的乳腺癌患者。
　　4 MAGE-A10蛋白表达与HER-2表达无相关性。MAGE-A11蛋白表达与HER-2表达呈正相关。HER-2表达阳性的乳腺癌患者中MAGE-A11蛋白的表达率明显高于HER-2表达阴性的乳腺癌患者。提示，MAGE-A11蛋白表达有可能与乳腺癌的预后不良有关。
　　5 MAGE-A10蛋白表达阳性的乳腺癌患者的生存率与MAGE-A10表达阴性的乳腺癌患者相比无明显差异。MAGE-A11蛋白表达阳性的乳腺癌患者的生存率与MAGE-A11表达阴性的乳腺癌患者相比明显降低。提示，MAGE-A11蛋白表达有可能是乳腺癌患者预后不良的一个重要标记。
　　第二部分 MAGE-A11表达载体的构建及对乳腺癌细胞增殖的影响
　　目的：构建带有GFP标签的MAGE-A11表达载体，并初步探讨MAGE-A11在过表达的情况下对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。
　　方法：利用基因重组技术构建带有GFP标签的MAGE-A11表达载体pCMV6-AC-MAGE-A11-GFP，并通过MTT分析和克隆形成实验的方法研究MAGE-A11过表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。
　　结果：
　　1成功构建了pCMV6-AC-MAGE-A11-GFP表达载体。
　　2将构建好的pCMV6-AC-MAGE-A11-GFP表达载体转染到MCF-7细胞中，Western-blot结果显示：与空载体对照组相比，转染pCMV6-AC-MAGE-A11-GFP表达载体后，MAGE-A11蛋白表达为阳性，提示表达载体可用于下一步实验。
　　3 MTT分析结果显示：将pCMV6-AC-MAGE-A11-GFP表达质粒转染乳腺癌细胞MCF-7中，同时设立空载体对照组，转染48 h后，细胞接种到96孔板中，用MTT方法检测接种24 h和48 h后细胞的增殖状况。结果显示，接种48 h后，转染MAGE-A11表达质粒组细胞的增殖状况与空载体对照组相比显著增高(p<0.05)。
　　4克隆形成实验结果显示：转染pCMV6-AC-MAGE-A11-GFP表达质粒并用G418筛选两周后，MCF-7细胞的克隆形成数为118±6，较空载体对照组(55±2)相比显著增加(p<0.05)，提示，MAGE-A11促进了人乳腺癌细胞MCF-7细胞的增殖。
　　结论：
　　1成功构建了pCMV6-AC-MAGE-A11-GFP表达载体。
　　2外源性MAGE-A11促进了人乳腺癌细胞MCF-7细胞的增殖。
　　第三部分肿瘤抗原MAGE-A11促进雌激素依赖型乳腺癌细胞增殖的分子机制
　　目的：研究MAGE-A11在雌激素依赖型乳腺癌细胞MCF-7中的促增殖作用机制。
　　方法：利用RT-PCR及Western-blot技术检测ER在乳腺癌细胞MCF-7中的表达状况。利用基因转染、RT-PCR及Western-blot技术检测在17β-estradiol存在的条件下不同转染系统中ER的下游靶基因Efp在mRNA和蛋白水平上的表达差异。利用基因转染和免疫共沉淀技术检测在17β-estradiol存在的条件下外源性的MAGE-A11蛋白与ER之间的蛋白相互作用。利用MTT分析和克隆形成实验的方法检测MAGE-A11对雌激素依赖型乳腺癌细胞增殖MCF-7的影响。
　　结果：
　　1鉴定乳腺癌细胞中ER的表达状况
　　RT-PCR和Western-blot结果显示，MCF-7细胞中ER表达阳性，MDA-MB-231细胞中ER表达阴性，提示，MCF-7细胞为ER阳性细胞，MDA-MB-231细胞为ER阴性细胞。
　　2 MAGE-A11对雌激素诱导的ER下游靶基因Efp表达的影响
　　RT-PCR和Western-blot结果显示，ER阳性乳腺癌细胞MCF-7用10 nM的17β-estradiol处理24 h后，ER的下游靶基因Efp在mRNA和蛋白水平上的表达均显著升高。单独转染MAGE-A11并不能促进Efp的mRNA和蛋白的表达，但外源性的MAGE-A11增加了雌激素依赖型的Efp的mRNA和蛋白表达水平。
　　3外源性MAGE-A11与ER之间的蛋白相互作用
　　本研究采用基因转染和免疫共沉淀的实验方法检测了在17β-estradiol存在的条件下外源性的MAGE-A11蛋白与ER之间的蛋白相互作用。结果显示，MCF-7细胞转染MAGE-A11表达载体后进行免疫共沉淀实验，利用GFP抗体识别蛋白裂解液中的外源性MAGE-A11蛋白，所得到的蛋白复合物中也包含了ER蛋白。以上结果提示，外源性MAGE-A11与ER之间的存在蛋白相互作用，MAGE-A11有可能通过与ER之间的蛋白相互作用增加ER诱导的Efp的表达。
　　4 MAGE-A11对雌激素依赖型乳腺癌细胞增殖的影响
　　MTT分析的实验结果显示，17β-estradiol处理后的MCF-7细胞增殖能力显著增加，MAGE-A11可增加17β-estradiol诱导的MCF-7细胞的增殖能力。克隆形成实验的结果显示，单独转染MAGE-A11可增加MCF-7细胞的克隆形成数，17β-estradiol处理后的MCF-7细胞克隆形成能力显著增高，MAGE-A11可增加17β-estradiol诱导的MCF-7细胞的克隆形成能力。以上结果提示，MAGE-A11可促进雌激素依赖型的乳腺癌细胞的增殖。
　　结论：
　　1 MCF-7细胞为ER阳性细胞，MDA-MB-231细胞为ER阴性细胞。
　　2在ER阳性的乳腺癌细胞中，在雌激素存在的情况下MAGE-A11有可能通过与ER相互作用，作为辅助激活因子增加ER诱导下游靶基因(如Efp)等)的能力，从而促进雌激素依赖型乳腺癌细胞的增殖。