活血化瘀通络中药对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其对血管内皮生长因子的影响

摘要

目的:应用链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导SD大鼠建立糖尿病(diabetesmellitus，DM)模型，给予活血化瘀通络中药复方及厄贝沙坦对该模型进行干预，通过观察大鼠的一般情况、生化指标、肾脏病理形态学变化以及肾皮质组织中血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的表达水平，来探讨VEGF与糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)的关系，以及活血化瘀通络中药复方对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及可能机制，为临床上治疗糖尿病肾病提供实验依据。
　　 方法:清洁级健康雄性SD大鼠48只，体重90-120g，适应性喂养一周后随机分为正常组(C)10只，造模组38只。造模组大鼠禁食12h后，一次性腹腔注射STZ55mg/kg，正常组注射等体积枸橼酸缓冲液。3天后随机血糖大于16.7mmol/1的大鼠为造模成功，死亡和未达标者予以剔除。造模成功后，将造模组大鼠随机分为模型组(M)11只，活血化瘀通络中药组(Z)10只，厄贝沙坦组(E)10只。中药组给予活血化瘀通络中药配方颗粒3.92g/kg/d灌胃，厄贝沙坦组给予厄贝沙坦24mg/kg/d灌胃，正常组及模型组给予等体积纯净水灌胃，每日一次，共16周。于用药第16周末，收集24h尿液并记录尿量测定尿蛋白排泄量（UAE）;禁食12h后，麻醉状态下称量体重;腹主动脉取血，分离血清，测定糖化血红蛋白(HbA1c)、血清白蛋白(ALB)、血肌酐(Cr)浓度;摘取右肾，去被膜后称重以计算肥大指数(HI)，切取部分肾皮质组织在光镜和电镜下观察肾脏病理改变，免疫组化法观察肾脏VEGF的表达;摘取左肾，去被膜后切取部分肾皮质组织放入冻存管，置于液氮中冻存，用westernblot和Real-timePCR的方法检测肾脏VEGF的表达水平。
　　 结果:
　　 1、实验大鼠的一般状况比较
　　 正常组大鼠精神良好，反应敏捷，眼睛有神，肌肉丰满，皮毛光泽柔顺，尾不弯曲，无畸形，饮食正常，粪便呈麦粒状，尿量正常。造模组大鼠均出现明显的多饮、多食、多尿症状，体重相对正常组减轻，并逐渐出现精神萎靡，卷曲拱背，毛色晦暗，尾巴苍白，少动抱团。在注射STZ第8周开始出现多种糖尿病并发症，如白内障、溃疡、颌下及腋部包块等，上述症状以模型组最为显著。在第16周时两治疗组大鼠一般情况较模型组为好。在实验过程中，不同阶段有大鼠死亡情况。注射STZ后72小时之内，2只大鼠死亡，5只大鼠血糖未达标准，原因可能与大鼠个体差异和操作有关，予以剔除。在治疗期间，模型组死亡4只，中药组和厄贝沙坦组大鼠各死亡2只，死亡原因可能为高血糖引起机体代谢紊乱，最终导致各脏器功能衰竭而死亡。
　　 2、各组大鼠体重，右肾重，肥大指数（右肾重/体重）的比较
　　 与正常组相比，模型组和两治疗组的体重明显减轻(P＜0.05)，模型组与两治疗组相比，体重无明显差异(P＞0.05)，两治疗组之间体重无明显差异(P＞0.05);右肾重各组间均没有明显差异(P＞0.05);与正常组相比，模型组和两治疗组肥大指数明显升高(P＜0.05)，与模型组相比，两治疗组肥大指数明显降低(P＜0.05)，两治疗组之间肥大指数无明显差异（P＞0.05）。
　　 3、各组大鼠生化指标的比较
　　 3.1、各组大鼠24h尿蛋白定量的比较
　　 与正常组相比，模型组及两治疗组24h尿蛋白定量均明显升高(P＜0.05);与模型组相比，两治疗组24h尿蛋白定量明显降低(P＜0.05);两治疗组之间没有明显差异(P＞0.05)。
　　 3.2、各组大鼠糖化血红蛋白的比较
　　 与正常组相比，模型组及两治疗组糖化血红蛋白均明显升高(P＜0.05)，模型组和两治疗组以及两治疗组之间无明显差异(P＞0.05)。
　　 3.3、各组大鼠血清白蛋白的比较
　　 与正常组相比，模型组血清白蛋白明显降低(P＜0.05)，与正常组和模型组相比，两治疗组均没有明显差异(P＞0.05)，两治疗组之间无明显差异(P＞0.05)。
　　 3.4、各组大鼠肾功能的比较
　　 正常组、模型组及两治疗组之间血肌酐均无明显差异(P＞0.05)。
　　 4、肾脏病理形态学观察
　　 4.1、光镜观察
　　 正常组大鼠肾小球结构清晰完整，未见明显肥大，毛细血管腔清晰无扩张，基底膜无增厚，系膜无增生，基质无明显改变;模型组大鼠肾小球的毛细血管球肥大，肾小囊腔呈裂隙状，基底膜增厚，系膜细胞增生，系膜基质增多，系膜区增宽;与正常组相比，两治疗组大鼠肾小球也有不同程度的病理改变，但与模型组相比，病变较轻。
　　 4.2、电镜观察
　　 正常组大鼠肾小球毛细血管基底膜结构清晰完整，均匀无增厚，上皮细胞足突分布均匀、无融合，内皮细胞未见异常，系膜区未见异常。模型组大鼠肾小球毛细血管基底膜均质性增厚，上皮细胞足突广泛融合，内皮细胞融合，系膜区扩大，系膜基质增多。两治疗组大鼠肾小球毛细血管基底膜轻度增厚，足细胞足突部分融合，系膜基质轻度增多。两治疗组间差异不明显。
　　 5、免疫组织化学方法检测肾皮质VEGF的表达
　　 结果显示:VEGF在正常组、模型组和两治疗组中均有表达，主要位于肾小管内，以远端小管和集合管为主，在近端小管也有表达，而在肾小球内只有少量表达或基本无表达。半定量分析结果显示:与正常组相比，模型组及两治疗组VEGF的表达明显增强(P＜0.05);与模型组相比，两治疗组VEGF的表达明显降低(P＜0.05);两治疗组间无明显差异(P＞0.05)。
　　 6、实时定量PCR方法检测肾皮质VEGFmRNA的表达
　　 与正常组相比，模型组和两治疗组肾皮质VEGFmRNA表达水平均明显增高(P＜0.05);与模型组相比，两治疗组肾皮质VEGFmRNA表达水平均明显降低(P＜0.05);两治疗组间无明显差异(P＞0.05)。
　　 7、Western-blot方法检测肾皮质VEGF的表达
　　 与正常组相比，模型组和两治疗组肾皮质VEGF表达水平均明显增高(P＜0.05);与模型组相比，两治疗组肾皮质VEGF表达水平均明显降低(P＜0.05);两治疗组间无明显差异(P＞0.05)。
　　 结论:
　　 1、糖尿病大鼠成模后16周可出现早期糖尿病肾病表现。此时，肾皮质组织中VEGF表达已明显升高。
　　 2、活血化瘀通络中药复方可以减少糖尿病大鼠尿蛋白的排泄，减轻肾脏病理损害，延缓糖尿病肾病的发生和发展。
　　 3、活血化瘀通络中药复方可以抑制糖尿病肾病大鼠肾皮质组织中VEGF的过表达，此作用与厄贝沙坦的功能相似，可能为其减少尿蛋白排泄的原因之一。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 实验大鼠的一般状况比较

2 各组大鼠体重，右肾重，肥大指数(右肾重／体重)的比较

3 各组大鼠生化指标的比较

4 肾脏病理形态学观察

5 免疫组织化学方法检测肾皮质VEGF的表达

6 实时定量PCR方法检测肾皮质VEGFmRNA的表达

7 Western-blot方法检测肾皮质VEGF的表达

附图

附表

讨论

1 立题依据

2 方药分析

3 实验结果分析

结论

参考文献

综述 血管内皮生长因子与糖尿病肾病

致谢

个人简历