黑色素瘤相关抗原MAGe-A9对p53转录活性及稳定性影响的实验研究

摘要

目的:
　　 野生型p53在监控细胞基因组DNA的完整性上发挥着“基因组卫士”的作用。正常情况下，细胞内p53蛋白的表达水平很低。细胞DNA受到损伤时，p53转录被激活并诱导其下游靶基因表达，从而发挥调控细胞周期、促凋亡的生物学作用。最近的研究表明，黑色素瘤相关抗原MAGE-A亚家族的一些成员与p53之间可发生相互作用，MAGE-A可抑制p53的转录活性，并可与MDM2结合，促进p53泛素化和降解，从而阻碍了肿瘤抑制因子p53功能的发挥。本课题旨在研究MAGE-A亚家族中MAGE-A9对p53转录活性及稳定性的影响，进而了解MAGE-A9在肿瘤发生发展中可能的信号通路及作用机制。
　　 方法:
　　 1.利用基因转染、RT-PCR、WesternBlot、荧光素酶报告基因分析等方法检测外源性MAGE-A9对p53靶基因p21WAF1表达的影响。
　　 2.通过细胞克隆形成以及MTT实验分析基因转染后MDA-MB-231细胞的增殖活性。
　　 3.利用基因转染、RT-PCR、WesternBlot研究MAGE-A9对p53表达的影响。
　　 4.采用放线菌酮蛋白合成抑制实验，分析不同转染组MDA-MB-231细胞中p53蛋白在放线菌酮作用不同时间后的表达情况。
　　 结果:
　　 1.RT-PCR分析结果显示，与转染空载体组相比，转染p53基因可以使MDA-MB-231细胞中p21WAF1mRNA表达水平增加(P＜0.05);共同转染p53基因和MAGE-A9基因后，p21WAF1mRNA表达水平均明显低于单独转染p53基因时的表达水平(P＜0.05);单独转染MAGE-A9基因后，MDA-MB-231细胞中p21WAF1mRNA表达水平与转染空载体组无明显差异(P＞0.05)。
　　 2.WesternBlot分析结果显示，转染p53基因后，MDA-MB-231细胞中p21WAF1蛋白表达水平明显高于p53未转染组(P＜0.05);与单独转染p53组相比，共转p53和MAGE-A9质粒组MDA-MB-231细胞中p21WAF1蛋白的表达水平明显降低(P＜0.05)。
　　 3.荧光素酶报告基因分析结果显示，对照组MDA-MB-231细胞的荧光素酶活性为1.00±0.00;在单独转染25ngp53质粒组MDA-MB-231细胞，p21WAF1启动子介导的荧光素酶活性为58.56±3.47，与对照组相比明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);共转染25ngp53质粒和逐渐增加量MAGE-A9质粒(100ng、200ng、400ng)后，MDA-MB-231细胞中p21WAF1启动子介导的荧光素酶活性分别为49.40±5.74、35.93±2.27、22.48±4.98，与单独转染p53组相比明显下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4.克隆形成实验结果显示，在MDA-MB-231细胞系中，转染空载体组，G418抗性的细胞克隆数为143.50±11.39;单独转染p53质粒组，G418抗性的细胞克隆数为53.25±6.08，与空载体对照组相比显著降低(P＜0.05);共同转染p53质粒和MAGE-A9质粒组MDA-MB-231细胞，G418抗性的细胞克隆数为115.50±7.94，与单独p53质粒组相比显著增加(P＜0.05);单独转染MAGE-A9质粒组，G418抗性的MDA-MB-231细胞克隆数为150.75±9.29，与空载体组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 5.MTT法分析结果显示，转染基因后的MDA-MB-231细胞接种96孔板24、48小时，空载体组、单独转染p53质粒组、共同转染p53和MAGE-A9质粒组、单独转染MAGE-A9质粒组MDA-MB-231细胞的相对增殖率分别为135.18％和337.23％、138.27％和228.89％、139.44％和291.51％、142.62％和330.71％。接种24小时后，各组间细胞的相对增殖率差异无统计学意义(P＞0.05)。接种48小时后，单独转染p53质粒组以及共转p53和MAGE-A9质粒组细胞的相对增殖率降低(P＜0.05);单独转染p53质粒组细胞的相对增殖率明显低于共转p53和MAGE-A9质粒组（P＜0.05）。
　　 6.在转录水平上MAGE-A9对p53表达影响的分析结果显示，转染空载体组、单独转染0.5μgp53质粒组、共同转染0.5μgp53和0.5μgMAGE-A9质粒组、共同转染0.5μgp53和1.0μgMAGE-A9质粒组MDA-MB-231细胞中p53与GAPDH条带的灰度值比分别为0.492±0.003、0.723±0.026、0.709±0.014、0.712±0.014。各实验组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 7.在翻译水平上MAGE-A9对p53稳定性影响的分析结果显示，转染空载体组、单独转染0.5μgp53质粒组、共同转染0.5μgp53和0.5μgMAGE-A9质粒组、共同转染0.5μgp53和1.0μgMAGE-A9质粒组MDA-MB-231细胞中p53与GAPDH条带的灰度值比分别为0.747±0.011、0.961±0.027、0.677±0.021、0.607±0.023。各组间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 8.放线菌酮蛋白合成抑制实验结果显示，单独转染p53质粒组，100μg/mL放线菌酮作用0、1、2、4、6小时后，MDA-MB-231细胞中p53与GAPDH蛋白条带的灰度值比分别为0.918±0.014、0.777±0.032、0.607±0.059、0.383±0.032、0.208±0.017;而共同转染p53质粒和MAGE-A9质粒组，100μg/mL放线菌酮作用0、1、2、4、6小时后，p53与GAPDH蛋白条带的灰度值比分别为0.890±0.070、0.495±0.039、0.268±0.032、0.165±0.017、0.084±0.018。两实验组中p53蛋白的表达水平在各时间点的差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 黑色素瘤相关抗原MAGE-A9可抑制p53转录活性，降低p53的稳定性，从而影响p53生物学功能的发挥。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 黑色素瘤相关抗原MAGE-A9对p53转录活性的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 黑色素瘤相关抗原MAGE-A9对p53稳定性的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 MAGE-A亚家族及其在肿瘤临床上的应用前景

致谢

个人简历