骶韧带成纤维细胞受力后细胞骨架系统变化的初步研究

摘要

目的:
　　 1、研究应变量不同的两种机械力对盆腔器官脱垂(pelvicorganprolapse，POP)患者与非POP患者骶韧带成纤维细胞骨架形态的影响及骨架蛋白中β-actin、β-tubulin与vinculin表达的调节。
　　 2、研究机械力与细胞骨架重塑的关系。
　　 3、从细胞骨架的变化探讨机械力在女性盆腔器官脱垂(pelvicorganprolapse，POP)发病机制中的作用。
　　 方法:
　　 1、研究对象:选取2011年10月-2012年9月在河北医科大学第二医院妇产科接受手术治疗的15例POP患者的骶韧带为病例组;同期因子宫良性病变行子宫全切的15例非POP患者的骶韧带作为对照组。两组患者均无子宫内膜异位症、糖尿病及呼吸、消化、心血管系统等影响细胞骨架代谢的疾病，术前3个月内未应用性激素治疗。病例组与对照组在年龄、产次、孕次、体重指数等方面比较，差异无统计学意义。
　　 2、取材:经河北医科大学第二医院伦理委员会同意，所有患者签署知情同意书。所取标本为两组患者近宫颈部分的骶韧带组织，4℃冷盒送实验室，整个取材运输过程小于2小时并要求严格无菌。
　　 3、成纤维细胞的原代培养和鉴定:采用组织块法进行骶韧带成纤维细胞的原代培养，通过倒置相差显微镜、HE染色及瑞姬染色进行细胞形态学观察，免疫细胞化学染色和免疫细胞荧光染色进行细胞鉴定。
　　 4、细胞力学实验:采用Flexcercell4000柔性基底拉伸加载系统，分别对3～5代处于对数期生长的对照组及病例组骶韧带成纤维细胞加力，加载过程在二氧化碳培养箱内进行。加载参数:幅度10％与20％，正弦波，0.5Hz，加载时间分别为:0、4、12、24小时。在设定的时间将病例组与对照组的细胞培养板取出立即进行免疫荧光染色。在激光共聚焦显微镜及免疫荧光显微镜下观察不同机械力对两组骶韧带成纤维细胞骨架中F-actin的影响，同时用免疫蛋白印迹技术测定受力前后骨架蛋白中β-actin、β-tubulin与vinculin表达含量的变化。所得数据采用SPSS13.0统计分析，以P＜0.05认为差异有统计意义。
　　 结果:
　　 1、所培养细胞呈长梭形或不规则三角形，边界清楚，约30天左右单层细胞达80％-90％汇合时呈放射状或漩涡状排列。免疫细胞化学染色及免疫细胞荧光染色波形蛋白表达阳性，角蛋白和平滑肌肌动蛋白表达阴性，结合取材部位证实为骶韧带成纤维细胞。
　　 2、在机械力作用下骶韧带成纤维细胞的形态及排列方式发生变化，在10％应变下随着受力时间的延长形态由原来的多形性成为单一的长梭形，排列方向趋于规则并垂直于最大应变方向，以24小时最明显;20％应变下部分细胞发生断裂及明显的皱缩，失去了原有的形态。
　　 3、在激光共聚焦显微镜及免疫荧光显微镜下可见FITC-phalloidin标记的细胞骨架微丝呈绿色荧光，PI标记的细胞核呈红色荧光，未加力时两组骶韧带成纤维细胞荧光染色强，应力纤维清晰可见;在10％应变的作用下两组骶韧带成纤维细胞内微丝纤维排列方向随加力时间延长出现对力场顺应性的变化，但其荧光标记强度呈现先下降后上升的趋势，4h时最弱，以后逐渐增强，于加力后24h荧光染色强度与静态不加力组接近;在20％应变作用下，随着加力时间的延长，细胞荧光强度持续减弱，于加力后24h可以清楚看到微丝结构破坏，部分崩解成团块状。此外，在不同应力的不同阶段，对照组细胞骨架微丝的荧光染色强度普遍较病例组要高。
　　 4、Westernblot凝胶电泳结果显示在10％应力作用下，对照组及病例组骶韧带成纤维细胞骨架蛋白中β-actin、β-tubulin的含量无明显变化(P＞0.05)，而vinculin的表达水平随加力时间的延长逐渐升高(P＜0.05);在20％应力作用下，两组骶韧带成纤维细胞骨架蛋白中β-actin、β-tubulin及vinculin的表达水平均呈现持续下降的趋势（P＜0.05）。此外，在不同应力的不同阶段，对照组细胞骨架蛋白中β-actin、β-tubulin、vinculin的表达水平普遍较病例组要高（P＜0.05）。
　　 结论:
　　 1、应变量不同的两种机械力可以改变细胞的形态和伸展方向，分别对骶韧带成纤维细胞骨架形态产生适应或破坏性的作用效果，并影响着骨架蛋白中β-actin、β-tubulin与vinculin的表达含量。
　　 2、机械力作用下的细胞骨架重塑在POP的的发生发展中发挥着重要作用，非POP患者较POP患者具有更稳定的细胞骨架系统。
　　 3、机械力在POP发病机制中起着重要作用。

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摘要

研究论文 骶韧带成纤维细胞受力后细胞骨架系统变化的初步研究

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材料与方法

结果

附图

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结论

参考文献

综述 机械刺激下成纤维细胞骨架系统的力信号功能

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