骶韧带成纤维细胞受力后细胞骨架的变化

摘要

目的:
　　 1、研究应变量不同的两种机械力对女性盆底功能障碍性疾病(pelvicfloor dysfunction，PFD)与非PFD患者的骶韧带成纤维细胞细胞骨架形态影响及骨架相关蛋白vimentin与α-actintin表达的调节。
　　 2、从细胞骨架的变化探讨力学因素在PFD发病中的作用。
　　 3、进一步探究骶韧带成纤维细胞在机械力作用下的改建机理和机械力信号在细胞内的转导机制，为PFD发病原因提供更多的理论依据。
　　 方法:
　　 1、研究对象；
　　 选取2011年10月-2012年9月在河北医科大学第二医院接受手术治疗的12例PFD患者的骶韧带为病例组;同期(非PFD)因子宫良性病变行子宫全切15例患者的骶韧带作为对照组。两组患者均无子宫内膜异位症和呼吸、消化、心血管系统疾病及糖尿病等影响细胞骨架代谢的疾病，术前3个月内未应用性激素治疗。
　　 2、取材；
　　 经河北医科大学第二医院伦理委员会同意，所有患者签署知情同意书。所取标本为取两组患者近宫颈部分的骶韧带组织，4℃冷盒送实验室，整个取材运输过程小于2小时。整个取材过程要求严格无菌。
　　 3、成纤维细胞的原代培养和鉴定；
　　 采用组织块法进行骶韧带成纤维细胞的原代培养，倒置相差显微镜进行细胞形态学观察，免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。
　　 4、细胞力学实验；
　　 采用Flexcercell4000柔性基底拉伸加载系统，分别选取15例3～4代指数生长期的两组骶韧带成纤维细胞通过flexcercell-4000柔性基底加载系统加力，加载过程在二氧化碳培养箱内进行。加载参数:幅度10％与20％，正弦波，0.5Hz，加载时间分别为:0、4、12、24小时，以静态不加力(0小时)组为对照。在设定的时间将病例组与对照组的细胞培养板取出立即进行免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察不同机械力对两组成纤维细胞骨架中vimentin的影响，同时用免疫蛋白印迹技术测定受力前后骨架相关蛋白α-actintin表达含量的变化。
　　 结果:
　　 1、所培养细胞呈长梭形或不规则三角形，边界清楚，约30天左右单层细胞达80％-90％汇合时呈放射状或漩涡状排列。免疫细胞化学染色波形蛋白表达阳性，角蛋白和平滑肌肌动蛋白表达阴性，结合取材部位证实为骶韧带成纤维细胞。
　　 2、在机械力作用下骶韧带成纤维细胞的形态及排列方式变化，随着受力时间的延长形态由原来的多形性成为单一的长梭形，排列方向趋于规则并垂直于最大应变方向，以24小时最明显。
　　 3、在10％应力作用下，对照组和病例组骶韧带成纤维细胞细胞骨架中vimentin的荧光染色强度在受力后4、12、24小时与静态不加力组相比无明显变化，随着加力时间延长，细胞排列方向趋于规则;在20％应力作用下，两组骶韧带成纤维细胞骨架中vimentin荧光染色较未加力时明显减弱，加力24h时细胞vimentin荧光染色基本消失;病例组细胞骨架中vimentin的荧光染色强度普遍较对照组要低。
　　 4、对照组骶韧带成纤维细胞在10％应变刺激下α-actintin0h、4h、12h、24h表达量分别为(0.864±0.006，0.964±0.004，0.768±0.004，1.051±0.004)，四者相比差异有统计学意义，P＜0.05;在20％应变刺激下α-actintin0h、4h、12h、24h表达量分别为（0.864±0.006，0.629±0.004，0.556±0.003，0.467±0.004），四者相比差异有统计学意义，P＜0.05。病例组中α-actmtm在10％应变刺激下0h、4h、12h、24h表达量分别为(0.738±0.004，0.627±0.003，0.558±0.005，0.795±0.004)，四者相比差异有统计学意义，P＜0.05;在20％应变刺激下0h、4h、12h、24h表达量分别为(0.738±0.004，0.545±0.004，0.421±0.003，0.421±0.003)，四者相比差异有统计学意义，P＜0.05。此外，对照组中α-actintin在各阶段表达量均比病例组要高。
　　 结论:
　　 1、机械应力可以改变细胞的形态和伸展方向，在适应性力作用下两组骶韧带成纤维细胞骨架中vimentin表达量无明显变化，α-actintin合成持续性增加;在破坏性力作用下，两组中vimentin与α-actintin均持续性下降;在各个阶段，对照组中二者的含量普遍较病例组要高。
　　 2、机械力在PFD盆底组织细胞骨架的变化中发挥着重要作用。
　　 3、机械力在PFD的发病机制中有一定的作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 方法步骤

结果

1 骶韧带成纤维细胞的鉴定

2 机械拉伸前后骶韧带成纤维细胞的形态变化

3 免疫荧光显微镜观察应力前后细胞骨架变化

4 Western blot免疫印迹技术观察应力前后细胞骨架蛋白表达量的变化

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 细胞骨架相关蛋白研究进展

致谢

个人简历