应用大块平铺法对人脐带间充质干细胞分离、传代、冻存及复苏的研究

摘要

目的:应用四种不同的培养方法进行人脐带间充质干细胞的分离、传代、冻存、复苏，比较各方法之间优劣，探索并建立一种简单、实用的人脐带间充质干细胞的培养方法，为再生医学以及实验研究提供新的培养人脐带间充质干细胞的方法。
　　 方法:分别以1大块平铺法;2传统组织块法;3胶原酶Ⅳ消化法;4.胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法，四种不同的方法对脐带间充质干细胞进行细胞分离、培养、传代、冻存、复苏。镜下观察细胞形态，记录各组细胞首次融合时间、各组成功率，并以台盼蓝染色法测定细胞活性，以第3代细胞应用流式细胞术鉴定细胞免疫表型。
　　 结果:1细胞形态:镜下可见贴壁细胞呈长梭形，无序生长，可呈涡旋状生长。2免疫表型鉴定:应用流式细胞术对大块平铺法培养的人脐带间充质干细胞进行免疫表型鉴定。结果显示:CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均为阳性表达，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均为阴性表达。3统计结果分析（由于胶原酶Ⅳ消化法无一例成功，则不做分析）。3.1首次融合时间:大块平铺法(17.81±0.85d)明显早于传统组织块法(24.89±0.97d)，差异有显著性(p＜0.05)，但明显晚于胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法(7.35±0.61d)，差异有显著性(p＜0.05)。3.2稳定传代:大块平铺法(11.08±0.74代)与传统组织块法(11.04±0.77代)无明显差别，差异无显著性(p＞0.05)，但明显长于胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法(6.82±0.64代)，差异有显著性(p＜0.05)。3.3细胞活性:大块平铺法(90.84±0.83％)与传统组织块法(90.67±0.88％)无明显差别，不具有统计学意义(p＞0.05），但明显高于胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法(75.06±0.90％)，有统计学意义(p＜0.05)。3.4成功率:大块平铺法与传统组织块法差异无显著性(p＞0.0167)，但明显高于胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法，差异有显著性(p＜0.0167)。
　　 结论:1脐带华通胶组织是人间充质干细胞的重要来源。2应用大块平铺法、传统组织块法以及胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法三种方法可成功培养人脐带间充质干细胞，而应用胶原酶Ⅳ消化法则很难成功培养人脐带间充质干细胞，原因在于华通胶组织中含有大量的透明质酸，单用胶原酶Ⅳ很难消化完全，需添加透明质酸酶联合消化方可行。3镜下可见人脐带间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，可呈无序生长，呈涡旋状生长。4大块平铺法、传统组织块法以及胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法培养的人脐带间充质干细胞均可稳定传代、冻存、复苏，复苏后细胞增殖稳定。5大块平铺法实验操作上省去了剪碎以及铺块等最为繁琐的过程，比传统组织块法更为简便，而以往研究表明，酶消化法操作繁琐，不如传统组织块法简单。胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法是酶消化法的一种，同样操作繁琐，大块平铺法操作明显较胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法简单，且原代培养获得MSCs的时间要短于传统组织块法，提高了获得人脐带间充质干细胞的效率;以往研究表明，传统组织块法培养的人脐带间充质干细胞细胞活性要优于酶消化法，而大块平铺法细胞活性与传统组织块法无差别，明显优于胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法;大块平铺法培养人脐带间充质干细胞的成功率与传统组织块法无差别，且明显高于胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法。6应用流式细胞术检测大块平铺法培养的人脐带间充质干细胞免疫表型表明:CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均为阳性表达，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均为阴性表达，符合间充质干细胞的免疫表型。
　　 因此大块平铺法是一种简单、实用的原代培养人脐带间充质干细胞的方法，本研究为再生医学以及实验研究提供了一种新的培养人脐带间充质干细胞的方法。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结果

1 HUCMSCs形态学观察

2 传代和扩增

3 HUCMSCs免疫表型鉴定

4 统计结果分析(首先由于胶原酶Ⅳ无一例成功，不做分析)

附图

附表

讨论

一 操作方法

二 实验结果

结论

参考文献

综述 人间充质干细胞的特性、临床应用及前景

致谢

个人简历