奥拉西坦对咪达唑仑在大鼠体内药代动力学的影响

摘要

目的:咪达唑仑属苯二氮卓类短效镇静剂，具有镇静、催眠、抗焦虑、抗惊厥、肌松和顺行性遗忘作用，临床常用于外科病人手术麻醉、ICU病人及机械通气病人的镇静治疗药物。咪达唑仑主要在肝脏经肝微粒体酶CYP3A4代谢，国内对其药代动力学和生物等效性的研究较多。
　　 奥拉西坦是一种环γ-氨基丁酸类促智药，临床常用于年老痴呆、多梗死性引发的痴呆及脑神经症、脑外伤等疾病的治疗。该药作用于谷氨酸盐促代谢受体，防止谷氨酸所致的神经毒性，在体内广泛分布，其中以肝脏、肾脏及肺内的浓度最高。目前，尚未见奥拉西坦对肝微粒体酶的影响相关研究。
　　 本研究拟建立简便易行的大鼠血浆中咪达唑仑的R-HPLC检测方法，大鼠在分别给予奥拉西坦和安慰剂使其达稳态后，再给予咪达唑仑，通过测定咪达唑仑的浓度，考察在大鼠体内奥拉西坦对咪达唑仑是否产生影响，从而确定奥拉西坦是否影响肝微粒体酶CYP3A4的活性，为临床联合用药提供理论依据。
　　 方法:
　　 1、给药方法及血浆样品采集。
　　 健康雄性SD大鼠40只，随机分为2组，每组20只。实验组每日1次灌胃奥拉西坦(200 mg·kg-1)，连续5天;对照组每天1次灌胃等量蒸馏水，连续5天。第6日，两组大鼠均静脉给予咪达唑仑10mg·kg-1，于不同的时间点取血，-40℃保存。
　　 2、血浆样品处理。
　　 取血浆200μl，加内标（150mg·L-1地西泮溶液）20μl，混匀后，加提取剂500μl(异丙醇∶乙酸乙酯=2∶8)，涡旋震荡1min，10000rpm离心5min，取上清液500μl，于37℃水浴氮气流吹干，100μl甲醇复溶，进样。
　　 3、色谱条件。
　　 Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5.0μm)，柱温30℃，流动相乙腈-水(62∶38)，流速1.0ml/min，检测波长225nm，进样量20μl，内标为地西泮。
　　 4、最低定量限及最低检测限的确定。
　　 1mg·L-1的咪达唑仑对照品溶液，以倍比稀释法稀释后注入色谱仪进行测定，直至S/N≥10即为最低定量限，S/N≥3为最低检测限。
　　 5、标准曲线的制备。
　　 配制浓度分别为0.10、0.25、1、5、10、20、30mg·L-1的咪达唑仑模拟血浆样品，按“血浆样品处理方法”处理后进样。以咪达唑仑的峰面积与内标的峰面积比值(Y)对血浆药物浓度(X)进行回归，得标准曲线方程。
　　 6、回收率。
　　 制备浓度分别为0.25、5、20mg·L-1的咪达唑仑模拟血浆样品，按照“血浆样品处理方法”处理后进样，以咪达唑仑峰面积与等量咪达唑仑对照品溶液直接进样的峰面积比值，为咪达唑仑的提取回收率;地西泮峰面积与等量地西泮溶液直接进样的峰面积比值，为内标提取回收率;根据标准曲线方程计算的测得浓度与加入理论浓度的比值，为方法回收率。
　　 7、精密度。
　　 分别制备低、中、高三种浓度的咪达唑仑模拟血浆样品，分别于一日内处理并测定，计算日内精密度;连续5天处理并测定，计算日间精密度。
　　 8、稳定性。
　　 5mg·L-1的咪达唑仑模拟血浆样品，按照“血浆样品处理方法”处理后，分别于0、1、2、3、4h测定，考察处理样品放置的稳定性;即刻处理并测定或-40℃保存5天后处理并测定，考察低温保存稳定性;即刻处理并测定或反复冻融3次后处理测定，考察反复冻融稳定性。
　　 9、药代动力学分析。
　　 根据标准曲线方程计算每只动物各个时间点的血浆药物浓度，采用DAS2.1.1药代动力学软件处理血药浓度-时间数据，自动拟合统计距，分别得到两组大鼠的药动学参数，并采用SPSS13.1统计学软件计算两组间参数差异有无统计学意义。
　　 结果:
　　 1、咪达唑仑保留时间为6.7min，地西泮保留时间为8.2min，血浆内源性物质不干扰咪达唑仑和地西泮的测定。
　　 2、咪达唑仑血浆药物浓度标准曲线方程:Y=0.0752X-0.0042(线性范围0.1～30mg·L-1，r=0.9999)，最低定量限为0.005 mg·L-1，最低检测限为0.001 mg·L-1。
　　 3、回收率:低、中、高三种不同浓度的咪达唑仑模拟血浆样品的提取回收率分别(85.31±4.49)％,（83.27±2.73）％和（90.71±7.43）％;内标提取回收率为(76.46±1.09)％;方法回收率分别为(109.8±4.54)％，(101.6±3.28)％和(104.9±4.30)％。
　　 4、精密度:日内精密度结果显示，低、中、高三种浓度血浆样品的RSD值分别为11.05％，3.23％和6.38％;日间精密度的RSD值分别为8.10％，4.68％和7.04％。
　　 5、稳定性:血浆样品低温保存5天或反复冻融3次性质稳定，处理血浆样品放置4h对测定无影响。
　　 6、药代动力学特征。
　　 对照组和实验组大鼠按既定方案给药后，药代动力学参数如下:t1/2分别为(0.89±0.58)h和(0.76±0.67)h;Cmax分别为(8.77±2.18)mg·L-1和(9.15±1.61) mg·L-1;AUC(0-t)分别为(3.29±0.64) mg·h·L-1和(3.65±0.68)mg·h·L-1;AUC(0-∞)分别为(3.48±0.49) mg·h·L-1和(3.63±0.54)mg·h·L-1;CL/F分别为(3.11±0.59) L·h·kg-1和(3.08±0.48) L·h·kg-1;V/L分别为(3.89±2.05)L·kg-1和(2.92±2.51)L·kg-1。
　　 结论:
　　 1、本实验建立了大鼠血浆中咪达唑仑浓度的HPLC测定方法，该方法能使咪达唑仑和内标有良好的分离，血浆中内源性杂质对测定结果没有影响;血浆样品低温保存5天或反复冻融3次性质稳定，处理血浆样品放置4h对测定无影响;该测定方法简单、准确、重现性好，适用于大鼠血浆中咪达唑仑的含量测定。
　　 2、大鼠在给予安慰剂或奥拉西坦达到稳态后再给予咪达唑仑，实验组的t1/2、Cmax、AUC(0-12)、AUC(0-∞)、CL/F和V/F与对照组相比没有显著性差异(P＞0.05)。因此，本实验结论为奥拉西坦对咪达唑仑药动学无影响，奥拉西坦对肝微粒体酶CYP3A4无影响。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 方法

结果

1 色谱条件

2 最低定量限及最低检测限

3 标准曲线方程

4 回收率

5 精密度

6 稳定性

7 药代动力学行为

附图

附表

讨论

1 流动相的选择

2 内标的选择

3 检测波长的确定

4 实验动物的选择

5 给药方法

6 采血时间点的选择

7 给药剂量的确定

8 药代动力学

结论

参考文献

综述 咪达唑仑的基础研究和临床应用相关性评价

致谢

个人简历