糖尿病性耳聋大鼠Connexin26、Connexin30表达与耳蜗病理学变化和发病机制探讨

摘要

第一部分:复制糖尿病大鼠模型
　　 背景:随着我国国民经济的发展，人民生活水平的不断提高，生活方式的改变以及社会的老龄化，糖尿病的患病率逐渐增高，严重威胁我国人民的健康。糖尿病是一种胰岛素相对或绝对缺乏而使血糖水平异常增高、脂肪和蛋白质代谢紊乱的一种代谢性疾病，糖尿病的并发症之一是听力损害。糖尿病性听力下降严重影响着人们的生活质量，因此越来越受到各方面的高度重视。为研究糖尿病性听力下降的发病相关机制，必需建立适时的糖尿病动物模型，我们依据国内外公认的糖尿病动物模型建模标准，复制动物模型并监测其血糖、体重、尿糖等相关指标，为进一步研究提供实验和理论依据。
　　 方法:120只Wistar大鼠随机分为4组:1型糖尿病实验组(n=40)、2型糖尿病实验组(n=40)、1型糖尿病对照组(n=20)，2型糖尿病对照组(n=20)。实验组的Wistar大鼠用两种不同饲养方法进行喂养。不同时间段取尾静脉全血用血糖仪测定血糖，并检测体重、尿糖等指标。每月对造模后糖尿病大鼠进行观察，包括精神状态、活动度、毛发光泽度、摄食、尿量、耳廓反射等情况。1型糖尿病大鼠随机血糖＞16.65mmol/L为成模标准;2型糖尿病大鼠随机空腹血糖≥7.8mmol/L为成模标准。
　　 结果:1、实验动物一般情况
　　 两型实验组大鼠均呈现明显糖尿病症状，出现饮水、饮食、尿量增多及消瘦等症状，毛发发黄无光泽，精神萎靡，活动迟缓，双侧耳廓反应欠灵敏，耳镜检查外耳道清洁，正常。正常对照组大鼠无饮水、饮食、尿量增多及消瘦等糖尿病表现，生长及营养状况良好，双耳情况正常。
　　 2、实验动物血糖变化
　　 1型糖尿病实验组大鼠在实验开始时（0月）随机血糖与对照组相比无统计学差异(P＞0.05)，造模后1、2、3、4、5月血糖实验组与对照组相比升高显著(P＜0.01)。
　　 2型糖尿病实验组大鼠在特殊饲料喂养8周后，空腹血糖与对照组相比明显升高(P＜0.05），注射STZ后1个月至5个月，血糖升高显著（与对照组相比P＜0.01）。
　　 3、实验动物尿糖变化
　　 两型模型对照组实验期尿糖均阴性，两组实验组造模后尿糖均为(+++或++++)，符合糖尿病动物成模模型标准。
　　 4、实验动物体重变化
　　 1型糖尿病实验组大鼠体重变化表现为0月时实验组与对照组无显著差异(P＞0.05)，造模后1、2、3、4、5月实验组大鼠体重呈持续降低趋势，与对照组相比差异显著(P＜0.01)。
　　 2型糖尿病实验组大鼠体重变化表现为特殊饲料喂养4周、8周时，实验组大鼠体重与对照相比显著增加（P＜0.01）。注射STZ后1个月，实验组大鼠体重比注射前有所降低（与特殊饲料喂养8周相比，(P＜0.05)，与对照相比无显著差异(P＞0.05);从成模后2月开始，实验组大鼠的体重呈下降趋势，与对照组相比差异显著(P＜0.01)。
　　 结论:本实验成功复制了近似于人类糖尿病症征的两种糖尿病大鼠模型，此两种模型建立方法简便易行，是糖尿病慢性并发症发病机制研究的理想动物模型。
　　 第二部分:糖尿病大鼠听功能变化与Cx26和Cx30在耳蜗中表达关系动态观察
　　 背景:耳聋是糖尿病慢性并发症之一。糖尿病性耳聋的主要特点是双侧的对称性神经性耳聋，表现为蜗性和或蜗后性耳聋，以高频听力下降为主，常伴有眩晕和前庭功能减退。国内外研究糖尿病性耳聋的发病机制主要从神经病变、微血管病变、血液流变学异常、免疫反应、遗传学等方面切入，但其发病机制至今尚不清楚，给干预或治疗糖尿病性耳聋带来了极大困难，这也是医学一直关注的问题。目前关于糖尿病内耳病变的报道多以外毛细胞散在缺失为主，其原因有待探讨。糖尿病患者的听力损害可能是耳蜗的微观结构和中枢听觉功能发生病变，因此，本研究将从宏观和微观两方面对此机理进行研究。连接蛋白是细胞间信号传递通道，属于缝隙连接，目前研究最多的连接蛋白是Cx26和Cx30。缝隙连接是细胞间通讯的结构基础，是细胞间电解质、第二信使、和代谢产物等信息传递的重要通道。内耳的缝隙连接除了输送营养物质、参与K+循环、交换代谢产物以外，还可能对内耳感觉上皮细胞的功能进行调控，维持内耳环境的稳定。K+是内耳淋巴液中产生听力的必不可少的离子，Cx26、Cx30又是K+转运的离子通道之一，因此Cx26，Cx30与K+是听力产生的必要条件。
　　 正常的哺乳动物耳蜗组织中存在Cx26及Cx30，维持耳蜗的正常功能。糖尿病性耳聋模型大鼠的耳蜗组织中Cx26及Cx30的表达情况如何？其表达量与听力下降是否有关？国内外尚无相关报道。因此，本研究采用糖尿病大鼠动物模型进行听性脑干反应(ABR)监测，探寻其听力功能动态变化特点。利用Westernblot方法，检测Cx26和Cx30在糖尿病实验组大鼠中的表达量，通过定量分析明确Cx26和Cx30表达量与动物听觉功能变化的相关关系，为探讨糖尿病性耳聋的发病机制提供分子生物学理论实验依据。
　　 方法:对照组和实验组大鼠均采用美国ICS-CHARTR型听性脑干监测仪分别进行听性脑干反应(ABR)测试，ABR阈值显著提高(≥40dBnHL)或波潜伏期及波间期延长作为入选糖尿病性耳聋的标准，进入下一步的实验观察。在预定的时间点将动物麻醉后断头，快速取出耳蜗，提取耳蜗蛋白，使用Westernblot方法，检测Cx26和Cx30在耳蜗组织中的表达趋势，验证其表达是否与实验组动物听功能变化相一致。
　　 结果:1、1型糖尿病大鼠ABR指标变化主要是Ⅱ波、Ⅴ波潜伏期、Ⅰ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅴ波间期的变化，造模后1个月对照组与实验组听力无明显差异(P＞0.05);造模后2、3、4、5个月对照组与实验组Ⅱ波、Ⅴ波潜伏期有显著差异(P＜0.01)、Ⅰ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅴ波间期(P＜0.05)有差异。
　　 2、2型糖尿病大鼠ABR指标变化主要是Ⅲ波、Ⅴ波潜伏期、Ⅰ-Ⅲ、Ⅰ-Ⅴ波间期的变化，造模后1个月对照组与实验组听力无显著差异(P＞0.05);造模后2、3、4、5个月对照组与实验组Ⅲ波、Ⅴ波潜伏期、Ⅰ-Ⅲ、Ⅰ-Ⅴ波间期(P＜0.01)具有显著差异。
　　 3、2型糖尿病大鼠模型中，耳蜗Cx26、Cx30蛋白表达水平与对照组大鼠相比有显著下降，随着造模时间的延长，Cx26和Cx30蛋白表达逐渐降低，Cx26蛋白较Cx30蛋白变化更为明显。
　　 结论:1、两型糖尿病性聋大鼠从造模2个月开始，大鼠的听力出现下降。两型糖尿病大鼠都有不同程度的听力损害，脑干听诱发电位可作为早期诊断其听力下降的指标之一。
　　 2、从造模2个月开始，实验组耳蜗组织中的Cx26、Cx30蛋白的表达水平有改变，Cx26和Cx30蛋白表达均有下降趋势，Cx26和Cx30变化与听功能改变相一致。
　　 第三部分:糖尿病性耳聋大鼠Cx26、Cx30表达变化与耳蜗毛细胞损伤关系初步研究
　　 背景:随着糖尿病患者人数的增加，由糖尿病引起的听力损害的报道也逐渐增多。糖尿病听力损害起病隐匿，易与老年性耳聋混淆，待发现时常发展为不可逆病变，严重影响患者的生活质量。对糖尿病性耳聋发病机制的深入研究，是预防糖尿病性耳聋不可缺少的环节。
　　 在糖尿病性耳聋大鼠模型中，尤其是2型糖尿病性耳聋大鼠模型，随着时间的延长，听力损失越明显，影响听觉功能。维持耳蜗正常机械-电转换功能以及保证听力的正常传导作用的分子是缝隙连接蛋白，糖尿病性耳聋大鼠耳蜗中的连接蛋白，在成模后两个月发生变化，病变时间越长，其表达降低越显著。为进一步证实听力损失与耳蜗组织中的Cx26和Cx30相关性，本研究采用荧光免疫染色方法、HE染色，检测Cx26和Cx30在实验组大鼠中的分布是否与耳蜗组织的蛋白表达水平及听力损失相一致，并进行了全耳蜗铺片，观察毛细胞损失情况与听力损失的相关性。进一步探讨了Cx26、Cx30表达与糖尿病性耳聋的发病机制关系，从分子水平为糖尿病性聋的发病机制提供新的研究方向和理论实验依据。
　　 方法:大鼠麻醉后断头，取出耳蜗，固定、脱钙、石蜡包埋、切片。挑选结构完整耳蜗石蜡切片，分别进行HE染色及免疫组织化学染色，检测Cx26和Cx30在糖尿病性耳聋大鼠耳蜗的表达分布，激光共聚焦显微镜观察耳蜗的结构形态及Cx26和Cx30的表达情况是否与耳蜗组织的病理变化相一致，最后通过全耳蜗铺片来观察毛细胞损失情况与听力损失的相关性。
　　 结果:1、两型糖尿病大鼠HE染色耳蜗侧壁组织、基底膜均出现实验组较正常组变薄，实验组大鼠耳蜗组织血管纹中管腔样结构与对照组耳蜗组织血管纹相比较出现减少，耳蜗侧壁及基底膜嗜伊红染色实验组较正常组深染，实验组与对照组大鼠耳蜗螺旋韧带中和螺旋神经节细胞数量比较有统计学差异(P＜0.05)，实验组大鼠耳蜗螺旋韧带中和螺旋神经节细胞数量少于对照组。
　　 2、两型糖尿病大鼠造模后1月实验组和对照组耳蜗内基底膜、血管纹和螺旋韧带中Cx26、Cx30表达无统计学差异(P＞0.05)，造模后2、3、4、5月实验组和对照组耳蜗内基底膜、血管纹和螺旋韧带中Cx26、Cx30表达水平显著低于对照组(P＜0.05)。
　　 3、两型糖尿病大鼠模型造模后1月实验组和对照组大鼠耳蜗铺片比较，内外毛细胞均无损伤。
　　 4、两型糖尿病大鼠模型造模后2月实验组和对照组大鼠耳蜗铺片比较，实验组较对照组内、外毛细胞排列散乱，但无缺失;造模后3月实验组较正常组内、外毛细胞排列散乱，其程度较2月时严重，但内外毛细胞无缺失;造模后4、5月实验组较正常组内、外毛细胞排列散乱，并出现内外毛细胞的缺失。这些均与实验组耳蜗组织中的Cx26和Cx30蛋白表达水平较正常组在明显下降一致，与ABR听力测试结果相符合。
　　 结论:1、Cx26及Cx30是听力产生的必不可少的连接蛋白，推测糖尿病大鼠听力损害可能与Cx26、Cx30相关。
　　 2、两型型糖尿病大鼠造模后1月实验组和对照组耳蜗内基底膜、血管纹和螺旋韧带中Cx26、Cx30表达水平无化，造模后2、3、4、5月实验组和对照组耳蜗内基底膜、血管纹和螺旋韧带中Cx26、Cx30表达显著低于对照组。与听力变化较为一致。
　　 3、耳蜗内外毛细胞实验组较对照组排列散乱，随时间延长毛细胞损伤程度加重，与蛋白表达及听力测试结果均一致。两型糖尿病大鼠模型在造模后2月Cx26和Cx30在耳蜗组织中的表达较对照组均有降低，随时间延长其降低程度越显著。提示糖尿病性耳聋的听力减退可能与Cx26和Cx30表达降低有关。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 复制糖尿病大鼠模型

前言

材料和方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 糖尿病大鼠听功能变化与Cx26和Cx30在耳蜗中表达关系动态观察

前言

材料和方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 糖尿病性耳聋大鼠耳蜗Cx26、Cx30分布变化与耳蜗毛细胞损伤关系初步研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一

综述二

致谢

个人简历