T细胞来源Exosomes调节妊娠丢失孕鼠母胎界面趋化因子及粘附分子表达的研究

摘要

目的:
　　 母胎界面免疫耐受异常是不明原因反复性自然流产(URSA)发生的重要机制。胚胎具有同种异体移植及自体移植的双重特性，胎儿及其附属物不被母体排斥并可在子宫内发育成熟，需要母体必须形成母胎免疫耐受。一旦这种免疫耐受出现异常则可引发流产。研究发现，母胎免疫耐受的建立和维持需由多种细胞和细胞因子介质的参与和协同作用。因此，研究母-胎免疫耐受调节的确切机制，寻找能够诱导母体对胎儿形成免疫耐受的治疗方法，是开发防治URSA药物、明确其免疫机理及指导临床合理应用的重要研究方面。
　　 目前通过淋巴细胞免疫治疗从而诱导母体对同种异体胚胎抗原形成免疫耐受在URSA的临床防治中起到积极作用。但是淋巴细胞稳定性差，不易保存，需要新鲜制备，加之操作标准不一，临床疗效不稳定，限制了临床上的推广。最近的研究发现，T细胞在生长增殖过程中可分泌释放一种称为Exosomes的膜性微囊结构。它恰恰克服了淋巴细胞免疫治疗的局限性。本研究采用流产实验动物模型，以分析T细胞来源的Exosomes调节母胎界面趋化因子(CXCR4/SDF-1、CXCR6)以及粘附分子(CD29、CD106)的表达，探讨其诱导母胎免疫耐受的相关免疫学机制。
　　 方法:
　　 1、无关的雄性个体脾细胞及Exosomes的制备和初步鉴定:处死BALB/c雄鼠，在无菌环境下解剖取脾，在获得单个细胞悬液后，采用蔗糖密度梯度离心以及超滤技术获得Exosomes;通过扫描、透射电镜观察Exosomes的形态结构，用紫外分光光度法测定其蛋白含量。
　　 2、建立流产动物模型及实验分组:将雌雄小鼠按2∶1合笼交配;CBA/J(♀)×BALB/c(♂)为正常妊娠对照动物模型(Control组)，CBA/J(♀)×DBA/2（♂）为流产动物模型。再将URSA孕鼠随机分为3组:1.妊娠丢失组(URSA组，于孕第4天着床期尾静脉注射生理盐水)2.细胞治疗组(Cellular Therapy组，于孕第4天尾静脉注射无关雄性个体脾细胞)3.非细胞治疗组(Non-cellular Therapy组，于孕第4天尾静脉注射无关雄性个体脾T淋巴细胞来源的非细胞成分Exosomes)。
　　 3、观察各组孕鼠胚胎发育的情况:于妊娠第14天将各组CBA/J孕鼠分别处死，在无菌环境下解剖孕鼠，取出胎盘组织，经过测量各径线后计算出胎盘组织体积，然后分别记录各组吸收胚胎及存活胚胎的个数，从而计算出各组胚胎吸收率以及妊娠丢失率。
　　 4、分析孕鼠母胎界面趋化因子以及粘附分子的表达:各组CBA/J孕鼠于妊娠第14天分别处死，在无菌环境下解剖孕鼠取出胎盘组织，制备石蜡包埋切片。免疫组化染色、图像分析，趋化因子SDF-1及其受体CXCR4、CXCR6以及粘附分子(CD29、CD106)等表达强度以灰度值(GS)表示，GS值大小与阳性表达强度反相关;以矩形走形计数200个细胞，分别计算各组阳性细胞表达的百分率。
　　 5、统计学处理:各组数据均通过SPSS13.0版本软件行正态性检验、方差齐性检验，采用卡方检验比较各组孕鼠胚胎发育情况;采用F检验对孕鼠胎盘趋化因子(CXCR4/SDF-1、CXCR6)以及粘附分子(CD29、CD106)的表达进行单因素方差分析(ANOVA)，S-N-K法进一步对多个样本均数间进行两两比较。显著性检验水准α=0.05。
　　 结果:
　　 1、无关雄性个体脾脏T淋巴细胞来源Exosomes的初步鉴定
　　 1.1、Exosomes的形态及超微结构的观察
　　 通过扫描及透射电镜下观察发现，T细胞来源Exosomes有完整的包膜，呈椭圆形或圆形杯口状，是一个直径约为30nm～100nm的被双层脂质膜包围的球体，内为低电子密度物质。经过紫外分光光度法蛋白定量分析，测定Exosomes的A280值为0.343±0.029。
　　 2、不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响
　　 经计算正常妊娠对照组(Control组)孕鼠胚胎吸收率是5.25％，未经治疗的反复妊娠丢失组(URSA组)是20.78％，无关雄性个体细胞治疗组、T细胞来源的Exosomes非细胞治疗组分别是7.81％、3.18％。与URSA组相比，细胞治疗组、非细胞治疗组的胚胎吸收率均下降显著(均P＜0.01)，均下降至Control组水平（均P＞0.05）;而且非细胞治疗组下降的更为显著(P＜0.05)。
　　 经计算正常妊娠对照组(Control组)孕鼠妊娠丢失率是20％，未经治疗的反复妊娠丢失组(URSA组)是62％，无关雄性个体细胞治疗组、T细胞来源的Exosomes非细胞治疗组分别是22％、16％。与URSA组相比，细胞治疗组、非细胞治疗组的妊娠丢失率均显著下降(均P＜0.01)，均下降至Control组水平（均P＞0.05）;而且非细胞治疗组下降的更为显著(P＜0.05）。
　　 3、不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠母胎免疫耐受状态的影响
　　 3.1、分析母胎界面趋化因子及其受体的表达
　　 3.1.1、CXCR4及其配体SDF-1的表达分析
　　 经计算正常妊娠对照组(Control组)孕鼠胎盘组织中CXCR4及其配体SDF-1阳性细胞表达率为（47.4％±3.9％、43.6％±4.0％），未经治疗的反复妊娠丢失组(URSA组)阳性细胞表达率显著下降为(16.4％±1.2％、18.0％±1.1％，P＜0.01);在经过细胞治疗以及非细胞治疗后阳性细胞表达率回升(分别为34.2％±4.5％、35.5％±4.9％，49.5％±7.1％、45.6％±3.2％均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;而且两治疗组组间比较有统计学意义(P＜0.05）。
　　 与正常妊娠对照组(Control组)孕鼠胎盘组织中CXCR4及其配体SDF-1的表达强度(118.5±6.71、120.56±5.67)相比，未经治疗的反复妊娠丢失组(URSA组)的表达强度下降显著(142.7±3.23、140.76±4.54，P＜0.01);在经过细胞治疗以及非细胞治疗后阳性细胞表达强度回升(分别为129.6±4.64、127.48±5.14，119.14±9.47、111.77±5.79均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;而且两治疗组之间的组间比较有明显统计学意义(P＜0.05）。
　　 3.1.2、CXCR6的表达分析
　　 经计算正常妊娠对照组(Control组)孕鼠胎盘组织中CRCX6阳性细胞表达率为(83.60％±3.85％)，未经治疗的反复妊娠丢失组(URSA组)阳性细胞表达率下降显著(50.40％±3.51％，P＜0.01);在经过细胞治疗以及非细胞治疗后阳性细胞表达率回升(分别为82.00％±4.00％、82.40％±2.61％，均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;而且两治疗组的组间比较无明显统计学意义(P＞0.05)。
　　 与正常妊娠对照组(Control组)孕鼠胎盘组织中CRCX6的表达强度(82.68±3.91)相比，未经治疗的反复妊娠丢失组（URSA组）表达强度下降显著(112.68±4.20，P＜0.01);在经过细胞治疗以及非细胞治疗后表达强度回升(分别为85.36±2.88、84.44±3.74，均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;而且两治疗组的组间比较无明显统计学意义(P＞0.05）。
　　 3.2、分析母胎界面粘附分子的表达
　　 3.2.1、CD29表达分析
　　 经计算正常妊娠对照组(Control组)孕鼠胎盘组织中CD29阳性细胞表达率为（43.2％±2.86％），未经治疗的反复妊娠丢失组(URSA组)阳性细胞表达率升高明显（83.0％±4.58％，P＜0.01）;在经过细胞治疗以及非细胞治疗后下降(分别为42.2％±1.92％，42.0％±2.73％，均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;而且两治疗组的组间比较无明显统计学意义(P＞0.05）。
　　 与正常妊娠对照组(Control组)胎盘组织中CD29的表达强度(116.54±3.33)相比，未经治疗的反复妊娠丢失组(URSA组)的表达强度明显升高(82.9±3.97，P＜0.01);在经过细胞治疗以及非细胞治疗后下降(分别为120.48±2.77、121.6±2.61，均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;而且两治疗组的组间比较无明显统计学意义(P＞0.05）。
　　 3.2.2、CD106表达分析
　　 经计算正常妊娠对照组(Control组)孕鼠胎盘组织中CD106阳性细胞表达率为(30.80％±2.33％)，未经治疗的反复妊娠丢失组(URSA组)阳性细胞表达率明显升高为(73.30％±1.75％，P＜0.01);在经过细胞治疗以及非细胞治疗后（分别为30.30％±1.78％，30.10％±1.67％，均＜0.01），可降至Control组水平(均/＞0.05)。而且两治疗组的组间比较无明显统计学意义(P＞0.05）。
　　 与正常妊娠对照组(Control组)孕鼠胎盘组织中CD106的表达强度(128.48±3.38)相比，未经治疗的反复妊娠丢失组(URSA组)表达强度上升明显(94±4.78，P＜0.01);在经过细胞治疗以及非细胞治疗后均下降(分别为129.58±3.10、130.7±4.66，均P＜0.01)至Control组水平（均P＞0.05）;而且两治疗组的组间比较无明显统计学意义(P＞0.05）。
　　 结论:
　　 1、无关雄性个体外周淋巴细胞或T细胞来源的非细胞成分Exosomes均可以有效地诱导母胎免疫耐受形成，从而有利于妊娠的顺利进行。且Exosomes发挥了比外周淋巴细胞更强大的诱导母胎免疫耐受的效应。
　　 2、无关雄性个体外周淋巴细胞及T细胞来源的非细胞成分Exosomes均可以通过共同或相似的作用途径引发孕鼠母胎界面趋化因子及粘附分子的表达变化从而有效诱导母胎免疫耐受。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学处理

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

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