T细胞来源Exosomes调节妊娠丢失孕鼠母胎界面CTLA-4FoxP3表达的研究

摘要

目的:正常妊娠的发生和维持有赖于母体对胚胎半同种抗原的免疫耐受，一旦该状态被打破将导致流产的发生。连续发生3次或3次以上的反复性妊娠丢失患者中，约50％并无明确临床病因，称为不明原因反复自然妊娠丢失(URSA)。研究妊娠过程中母胎免疫耐受形成的确切机制，诱导母胎免疫耐受的形成是治疗URSA的关键。
　　目前国内外多采用丈夫或第三方淋巴细胞对患者进行主动免疫治疗，但是细胞需新鲜制备，且稳定性差、不易保存，具有明显局限性，不利于临床推广。本研究采用自发性流产动物模型，通过过继转输淋巴细胞及其来源Exosomes，分析T细胞来源Exosomes调节妊娠丢失孕鼠母胎界面CTLA-4及FoxP3表达的变化，探究Exosomes诱导母胎免疫耐受机制。
　　方法:
　　1雄性无关个体脾细胞及其Exosomes的制备:摘眼球放血后断颈处死BALB/c雄鼠，无菌条件下解剖取脾组织，制备脾单个细胞悬液，采用蔗糖密度梯度离心联合超滤技术制取脾脏T细胞来源Exosomes。
　　2建立妊娠丢失实验动物模型及实验分组:雌雄小鼠随机按2∶1合笼交配;以CBA/J(♀)×BALB/c（♂）为正常妊娠对照组(Control组)，以CBA/J(♀)×DBA/2(♂)建立妊娠丢失动物模型。将流产孕鼠随机分为3组分别为:妊娠丢失组（URSA组，孕第4日着床期尾静脉注射生理盐水），细胞治疗组（Cellular Therapy组，孕第4日着床期尾静脉注射雄鼠脾细胞），非细胞治疗组(Non-cellular Therapy组，孕第4日着床期尾静脉注射Exsomes)。
　　3各组胚胎发育情况的观察:于妊娠第14日处死各组CBA/J孕鼠，无菌条件下解剖，取胎盘组织，测量胎盘各径线计算胎盘体积，分别计数各组胚胎吸收及存活个数，计算各组胚胎吸收率及妊娠丢失率。
　　4孕鼠母胎界面CTLA-4、FoxP3的免疫组化检测:制备孕鼠胎盘织石蜡包埋切片，免疫组化染色后进行图像分析，CTLA-4、FoxP3表达强度以灰度值(GS)表示，数值大小与阳性表达强度呈反相关;以矩形走形计数200个细胞，计算各组阳性细胞表达百分率。
　　5统计学处理:各组数据均通过SPSS13.0版本软件进行正态性、方差齐性检验。采用卡方检验比较各组孕鼠胚胎发育情况，采用F检验对孕鼠胎盘CTLA-4以及FoxP3的表达进行单因素方差分析(ANOVA)，S-N-K法进一步对多个样本均数进行两两比较。
　　结果:
　　1不同过继转输对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响
　　Control组孕鼠的胚胎吸收率为5.78％，URSA组显著升高至21.17％(P＜0.0005)，细胞治疗组、非细胞治疗组分别为6.93％、3.25％。与URSA组相比，细胞治疗组及非细胞治疗组胚胎吸收率均显著下降(均P＜0.01)，并且均下降至Control组水平（均P＞0.05）;非细胞治疗组胚胎吸收率显著低于细胞治疗组(P＜0.05）。
　　Control组孕鼠的妊娠丢失率为20％，URSA组显著升高至64％(P＜0.0005)，细胞治疗组、非细胞治疗组分别为24％、16％。与URSA组相比，细胞治疗组及非细胞治疗组妊娠丢失率均显著下降(均P＜0.01)，且均下降至Control组水平（均P＞0.05）;两治疗组组间比较无明显差异(P＞0.05)。
　　2妊娠丢失孕鼠母胎界面CTLA-4、FoxP3表达变化的分析
　　2.1母胎界面CTLA-4表达变化的分析
　　Control组孕鼠胎盘组织中CTLA-4阳性细胞百分率为31.60％±2.41％，URSA组显著下降至24.80％±2.86％(P＜0.01)，细胞治疗以及非细胞治疗后阳性细胞表达率明显回升(分别为34.80％±1.92％、40.40％±5.94％，均P＜0.05)至Control组水平;且非细胞治疗组回升更明显，两治疗组组间比较有统计学意义(P＜0.05)。
　　与正常对照组孕鼠胎盘组织中CTLA-4表达GS值118.78±10.97相比，妊娠丢失组(URSA组)的表达GS值115.34±11.02，细胞治疗组及非细胞治疗组阳性细胞表达强度分别为127.24±4.08、125.98±6.93;四组之间的组间比较均无明显统计学意义(P＞0.05)。
　　2.2母胎界面FoxP3表达变化的分析
　　control组孕鼠胎盘组织中FoxP3阳性细胞百分率为32.40％±4.50％， URSA阳性细胞百分率显著下降至23.4％±2.61％(P＜0.01)，细胞治疗以及非细胞治疗后阳性细胞表达率明显回升(分别为30.00％±3.39％、45.80％±7.16％，均P＜0.05)至Control组水平;且两治疗组组间比较有统计学意义(P＜0.05)。
　　与正常对照组孕鼠胎盘组织中FoxP3表达强度(116.05±2.48)相比，妊娠丢失组(URSA组)的表达强度115.59±3.64，差异无明显统计学差异(P＞0.05);细胞治疗组及非细胞治疗组阳性细胞表达强度分别为115.47±3.44，110.17±4.19;经非细胞治疗后表达强度增强，但两治疗组之间及与control组、URSA组的组间比较均无明显统计学意义（P＞0.05）。
　　结论:
　　1过继转输雄性无关个体外周T淋巴细胞或其来源的非细胞成分Exosomes均可诱导有效的母胎免疫耐受，且非细胞成分Exosomes可诱导较外周淋巴细胞更强大的母胎免疫耐受效应。
　　2雄性无关个体外周T淋巴细胞及其来源的非细胞成分Exosomes可通过相似途径调节母胎界面负向免疫调控分子CTLA-4、FoxP3数量变化，从而诱导有效的母胎免疫耐受。

目录

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 调节性T细胞与Th17细胞免疫失调在临床疾病中的研究进展

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