Caveolin-1EGFR突变非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂敏感性的影响

摘要

目的:肺癌是当今全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，每年新增患者人数为120万，其中80％-85％为非小细胞肺癌(non-small celllung cancer, NSCLC)。大多数NSCLC患者在初诊时已为晚期。晚期肺癌标准一线化疗方案为含铂双药方案，其在延长患者的总生存期、提高患者生存质量等方面均不理想。近年来随着分子生物学的发展，分子靶向药物以其特异性强、疗效明显、副反应小等优点在晚期NSCLC的治疗中被广泛应用。
　　表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是具有酪氨酸激酶活性的ErbB(HER)家族中的一员。表皮生长因子受体家族包括:ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)、ErbB4(HER4)四个成员。其中EGFR在40-80％的NSCLC中异常活化，EGFR异常活化常提示预后不佳。EGFR通过与其配体结合，形成二聚体，进而激活胞内段的酪氨酸激酶区，最终激活多条受体介导的信号转导通路，调节细胞的增殖、分化和存活。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growthfactor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）通过与ATP竞争性结合EGFR胞内段酪氨酸激酶区域的ATP结合位点，阻止配体与受体结合后引起的酪氨酸激酶的磷酸化，抑制EGF与EGFR结合后触发的信号转导通路，进而达到抑制肿瘤生长的目的。吉非替尼(Gefitinib)是目前最常用于治疗晚期具有EGFR突变NSCLC的EGFR-TKI。但在吉非替尼的应用中，大多数患者在1年内都会出现耐药现象。目前公认的对吉非替尼耐药的主要原因为T790M突变和c-MET基因扩增。但仍有其它的耐药机制尚未查明。
　　小凹蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)是分子量为21-24KDa的膜内在蛋白，是膜内陷囊泡(caveolae)的重要标志性结构蛋白。Cav-1由178个氨基酸残基组成，中间的疏水残基(102-134)在膜结构上形成特殊的发卡样镶嵌在细胞膜内，将Cav-1蛋白分成N端及C端两个区域，其中N端的82-101残基为主要的功能区域，该区域通过与EGFR相连接，从而调控EGFR酪氨酸激酶的活性。因此，我们推测Cav-1可能对具有EGFR突变的NSCLC酪氨酸激酶抑制剂敏感性产生影响。
　　为证实上述设想，本研究利用体外培养具有EGFR突变的NSCLC细胞PC-9，通过:(1)质粒转染技术，建立过表达Cav-1的稳定细胞株;(2)MTT比色分析法、划痕修复实验、Transwell法检测吉非替尼对稳定转染细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;(3) Western blot法检测吉非替尼对稳定转染细胞EGFR及其下游信号通路中各激酶活化水平的影响。旨在从细胞、分子水平探讨Cav-1影响EGFR突变NSCLC细胞PC-9酪氨酸激酶抑制剂敏感性的作用机制，为解决EGFR-TKIs耐药问题提供新靶点。
　　方法:
　　1.质粒转染技术建立过表达Cav-1的稳定细胞株将含人全长Cav-1基因的pcDNA3.1质粒和空质粒分别转染人NSCLC细胞PC-9，经G418抗性筛选，得到过表达Cav-1的稳定转染细胞株(PC-9/Cav-1)及其对照组细胞（PC-9/pcDNA3.1）;利用实时定量PCR和Western blot检测稳定转染细胞株中Cav-1 mRNA和Cav-1蛋白的水平。
　　2.MTT比色分析法检测吉非替尼对稳定转染细胞增殖能力的影响将PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1细胞分别接种于96孔板，次日换用含不同浓度吉非替尼(0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56μmol/L)的完全1640培养基继续培养，结束前4h加入MTT，通过测定各孔的吸光度(OD)值，计算细胞生长抑制率和吉非替尼的半数抑制浓度(IC50)。
　　3.划痕修复实验检测吉非替尼对稳定转染细胞株迁移能力的影响将PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1细胞分别接种于24孔板，待细胞贴壁生长达80-90％时，用10μl移液器吸头划痕，PBS洗去漂浮的细胞，两种细胞都分别于完全1640培养液及含浓度为0.015μmol/L吉非替尼的完全1640培养液中继续培养，在倒置显微镜下观察并拍照，每6h拍照一次，直至划痕愈合，测量划痕宽度变化，计算细胞迁移率。迁移率=（划痕初始宽度—目前宽度）/2/划痕初始宽度×100％。
　　4.Transwell法检测吉非替尼对稳定转染细胞侵袭能力的影响铺基质胶于Transwell小室的上室，将PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1细胞分别接种子上室，两种细胞都分别于无胎牛血清的1640培养液及含浓度为0.015μmol/L吉非替尼的无胎牛血清1640培养液中培养，下室放入含10％胎牛血清的1640培养液，继续培养24h后，95％冰乙醇固定，HE染色，显微镜下拍照，每个小室随机选取上、下、左、右及中心共5个视野，计算穿膜细胞数。
　　5.Western blot检测吉非替尼对稳定转染细胞EGFR活化水平及其下游信号通路分子的影响将PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1细胞分别接种于35mm培养皿，予以浓度为0.015μmol/L吉非替尼进行药物干预，分别于0h、8h后，收集细胞，提取总蛋白，Western blot检测p-EGFR、EGFR、p-ERK、ERK、p-Akt、Akt、Cav-1的蛋白水平，β-actin作为内参蛋白。
　　结果:
　　1.稳定转染细胞中Cav-1的水平检测
　　1.1 稳定转染细胞Cav-1 mRNA水平的变化实时定量PCR检测结果显示，PC-9/Cav-1细胞Cav-1 mRNA的相对定量值（4.07±0.08）明显高于PC-9/pcDNA3.1细胞(1.04±0.09)，有统计学意义(P＜0.01)。
　　1.2 稳定转染细胞Cav-1蛋白水平的变化Western blot检测稳定转染细胞Cav-1的蛋白水平，蛋白条带经灰度扫描定量及统计分析，PC-9/Cav-1细胞Cav-1蛋白的相对表达量（2.51±0.08）明显高于PC-9/pcDNA3.1细胞（0.19±0.01），有统计学意义(P＜0.01)。
　　2.稳定转染细胞吉非替尼敏感性的变化
　　2.1 稳定转染细胞吉非替尼的IC50MTT法检测吉非替尼对稳定转染细胞的增殖能力的影响，结果显示:给予不同浓度吉非替尼作用的PC-9/Cav-1细胞的生长抑制率均低于相应浓度的PC-9/pcDNA3.1细胞，差异有统计学意义(P＜0.05); PC-9/Cav-1组吉非替尼的IC50值（0.04±0.01）明显高于PC-9/pcDNA3.1组(0.015±0.01)，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明PC-9/Cav-1细胞对吉非替尼的敏感性低于PC-9/pcDNA3.1细胞。
　　2.2 稳定转染细胞迁移能力的变化及吉非替尼对其的影响划痕修复实验检测细胞迁移能力的结果显示:在无吉非替尼作用下，PC-9/Cav-1组细胞6h、12h、18h的迁移率(20.10±0.01％，26.64±0.01％，50.00±0.00％)均明显高于PC-9/pcDNA3.1组(15.25±0.00％，20.44±0.02％，22.47±0.01％)，均有统计学意义（均P＜0.01）;在0.015μmol/L吉非替尼作用下，PC-9/Cav-1组细胞6h、12h、18h的迁移率（14.89±0.02％，22.44±0.01，25.08±0.02％）明显高于PC-9/pcDNA3.1组细胞（5.61±0.01％，9.90±0.02％，12.10±0.00％），均有统计学意义(P＜0.01)。
　　2.3 稳定转染细胞侵袭能力的变化及吉非替尼对其的影响Transwell法检测细胞侵袭能力的结果显示:无吉非替尼作用的PC-9/Cav-1组穿膜细胞数(93.00±11.68)明显多于PC-9/pcDNA3.1组(66.40±6.02)，有统计学意义(P＜0.01);在0.015μmol/L吉非替尼作用下，PC-9/Cav-1组穿膜细胞数(56.20±4.87)明显多于PC-9/pcDNA3.1组细胞(23.20±3.19)，有统计学意义（P＜0.01）。
　　3.吉非替尼对稳定转染细胞EGFR活化水平及其下游信号通路分子的影响Western blot检测0μmol/L、0.015μmol/L吉非替尼作用后稳定转染细胞中各蛋白的表达水平，经灰度扫描，结果显示:0μmol/L、0.015μmol/L吉非替尼作用后，PC-9/Cav-1组p-EGFR的水平（1.22±0.02，1.03±0.01）均明显高于PC-9/pcDNA3.1组（0.74±0.04，0.51±0.02），均有统计学意义(P＜0.01);PC-9/Cav-1组p-ERK的水平（0.42±0.00，0.18±0.00）均明显高于PC-9/pcDNA3.1组（0.22±0.01，0.04±0.01），均有统计学意义(P＜0.01);PC-9/Cav-1组p-Akt的水平（1.88±0.30，0.56±0.04）明显高于PC-9/pcDNA3.1组（1.27±0.17，0.28±0.04），均有统计学意义(P＜0.01)。
　　结论:
　　1.增强Cav-1的表达水平可促进EGFR突变NSCLC PC-9细胞的增殖、迁移和侵袭;Cav-1通过调控PC-9细胞EGFR的活化（磷酸化）水平，影响MAPK/ERK及PI3K/Akt信号转导通路激酶的活化，进而影响PC-9细胞的生物学行为。
　　2.Cav-1通过减弱吉非替尼对PC-9细胞EGFR及其下游MAPK/ERK和PI3K/Akt信号转导通路激酶活化的抑制作用，降低PC-9细胞对吉非替尼的敏感性，减弱吉非替尼对PC-9细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 稳定转染细胞中Cav-1的水平检测

2 稳定转染细胞吉非替尼敏感性的变化

3 吉非替尼对稳定转染细胞EGFR活化水平及其下游信号通路分子的影响

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 非小细胞肺癌的分子靶向治疗

致谢

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