TIPE2、FOXP3、CTLA-4mRNA在慢性丙型肝炎患者PBMCs中的表达及意义

摘要

目的：
　　丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)为单股正链RNA病毒，全长为9.6kb。目前全世界近3％的人口为HCV感染者，其中50-80％以上的患者由急性转为慢性持续感染，甚至发展为肝硬化、肝细胞癌。研究发现固有免疫系统和获得性免疫系统均参与了HCV感染、清除及慢性化过程，但其确切机制尚不十分清楚。TIPE2(Tumor necrosis factor-α-inducedprotein8-like2，TNFAIP8L2)，即肿瘤坏死因子α诱导蛋白8型-2，是新近发现的一种免疫信号转导通路重要调节器。TIPE2是先天性免疫及获得性免疫的负性调节者，在炎症性疾病中发挥重要作用，也通过作用于Ras信号通路提供从炎症到肿瘤的分子桥梁。先前的研究表明TIPE2不仅高表达于免疫细胞和组织，如淋巴结、淋巴细胞和单核细胞等，也表达于其他非免疫细胞，如腺上皮细胞、分层或假复层上皮细胞及肝细胞、神经元细胞、软骨细胞等。而且对人TIPE2特性的研究表明TIPE2可能参与多种疾病的发生发展，如系统性红斑狼疮、糖尿病肾病、慢性乙型肝炎、肝癌、肾癌等，但具体机制尚不清楚。Luan等应用蛋白印迹法(Western blot)和RT-PCR检测发现，从BALB/C小鼠脾脏分离提取的CD4+CD25+Treg细胞（简称Treg细胞）中可以检测到TIPE2的表达，且能增强Treg细胞的免疫抑制作用，提示TIPE2基因可能与Treg细胞介导的免疫调控机制有关，但是其具体机制尚不十分清楚。Treg细胞是一群具有免疫抑制作用的T细胞亚群，在感染、肿瘤免疫和移植中发挥了重要作用。据报道，Treg细胞可分泌免疫抑制因子从而直接抑制效应性T细胞的功能。在很多肿瘤疾病中，Treg细胞的广泛浸润提示着预后差、生存率低。人叉头样转录因子p3（forkhead/winged helix transcription factor p3，FOXP3）基因是转录因子forkhead/winged-helix家族成员之一，已被广泛认可是Treg细胞的特异性标记物，是调控Treg细胞发育、分化及成熟的关键转录因子。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associatedantigen4，CTLA-4)是T细胞活化的负性调节子，是Treg细胞的细胞表面分子，对T细胞活化有着抑制作用。鉴于免疫系统内TIPE2基因的正常表达可以有效的防止机体过度反应和维持免疫稳态，我们推测TIPE2基因和FOXP3、CTLA-4在慢性丙型肝炎发病机制中具有某种关联性。
　　因此，本课题的主要目的是通过检测TIPE2基因及FOXP3、CTLA-4在慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcells，PBMCs)中的表达情况，一方面了解慢性丙型肝炎患者PBMCs中TIPE2基因表达情况，另一方面探讨TIPE2和FOXP3、CTLA-4在慢性丙型肝炎发病机制及进展中的作用，为进一步阐明TIPE2在慢性丙型肝炎发生和发展中的调控作用奠定基础。
　　方法:
　　1病例选择
　　慢性丙型肝炎患者60例，男31例，女29例，平均年龄49.40±14.31岁，均为2012年5月至2013年10月河北医科大学第三医院中西医结合肝病科门诊及住院患者，诊断均符合2000年9月西安会议修订的病毒性肝炎防治方案标准[1]及2004年丙型肝炎防治指南修订的诊断标准[2]。同时排除其他合并病毒性肝炎及肝脏疾病。同期选择健康志愿者42例，男12例，女30例，平均年龄为50.21±8.51岁。所有患者及健康志愿者均清晨空腹抽取抗凝静脉血7ml，用于分离PBMCs检测。抽取不抗凝静脉血5ml，分离血清备用。
　　2治疗方法
　　所有慢性丙型肝炎患者均给予干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗，根据白细胞及中性粒细胞减少情况，给予升白药物治疗。肝功能异常患者给予保肝降酶、退黄等治疗。
　　3外周血单个核细胞中TIPE2、FOXP3、CTLA-4基因检测
　　Ficoll密度梯度离心法常规分离PBMCs，Trizol一步法提取PBMCs中的总RNA，利用紫外分光光度计测量RNA，吸光度(A)260/(A)280nm的值在1.8-2.0时用于实验，利用M-MLV逆转录酶合成制备cDNA，应用Primer5.0设计软件设计合成特异性引物，RT-PCR检测TIPE2、FOXP3、CTLA-4 mRNA的表达。
　　4血清检测
　　留取慢性丙型肝炎患者不抗凝静脉血5ml，分离血清，全自动生化仪酶法检测肝功能，ELISA法测抗-HCV，实时荧光定量PCR探针法检测 HCV-RNA。
　　结果:
　　1慢性丙型肝炎患者PBMCs中TIPE2基因的表达及与抗病毒治疗的关系
　　结果显示慢性丙型肝炎患者PBMCs中TIPE2 mRNA的表达水平较健康对照组显著降低（0.50±0.19 vs0.71±0.17，P＜0.01）;其中21例慢性丙型肝炎患者在抗病毒治疗前后分别检测，结果显示PBMCs中TIPE2mRNA水平治疗后较治疗前明显升高(0.48±0.12 vs0.59±0.12，P＜0.01)。
　　2慢性丙型肝炎患者PBMCs中FOXP3基因的表达及与抗病毒治疗的关系
　　慢性丙型肝炎患者PBMCs中FOXP3 mRNA的表达水平较健康对照组明显升高（0.77±0.38 vs0.40±0.09，P＜0.01）;21例慢性丙型肝炎患者在抗病毒治疗前后分别检测，结果显示PBMCs中FOXP3 mRNA水平治疗后较治疗前明显下降（0.85±0.35 vs0.50±0.06，P＜0.01）。
　　3慢性丙型肝炎患者PBMCs中CTLA-4 mRNA基因的表达及与抗病毒治疗的关系
　　慢性丙型肝炎患者PBMCs中CTLA-4 mRNA的表达水平较健康对照组显著升高（0.67±0.19 vs0.44±0.13，P＜0.01），21例慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗前后分别检测，结果显示PBMCs中CTLA-4 mRNA水平治疗后较治疗前明显下降（0.70±0.19 vs0.55±0.14，P＜0.01）。
　　4 TIPE2基因的表达与慢性丙型肝炎临床指标的相关性
　　分析慢性丙型肝炎患者临床资料，依据慢性丙型肝炎患者血清中HCV-RNA、ALT、AST、TBil水平，将其分为HCV-RNA低水平组（HCV-RNA≤1×105IU/ml）和HCV-RNA高水平组(HCV-RNA＞1×105IU/ml);ALT正常组(ALT≤40U/L)和异常组(ALT＞40U/L);AST正常组(AST≤40U/L)和异常组(AST＞40U/L)以及TBil正常组(TBiL≤20μmol/L)和异常组（TBil＞20μmol/L），统计分析显示，慢丙肝患者PBMCs中TIPE2 mRNA的表达水平HCV-RNA在低水平组显著高于高水平组（0.63±0.17 vs0.37±0.10，P＜0.01），在ALT、AST、TBil正常组显著高于异常组(ALT，0.61±0.17 vs0.37±0.10，P＜0.01; AST，0.61±0.17 vs0.36±0.10,P＜0.01; TBil,0.59±0.18 vs0.36±0.10, P＜0.01),且与ALT、AST水平呈负相关(ALT，r=-0.529，P＜0.01;AST，r=-0.567，P＜0.01），与HCV-RNA、TBil水平无明显相关关系。
　　5 TIPE2的表达与FOXP3、CTLA-4表达的相关性
　　进一步应用SPSS13.0分析显示，TIPE2的表达与FOXP3、CTLA-4呈负相关，相关系数为(FOXP3，r=-0.563，P＜0.01, CTLA-4，r=-0.613，P＜0.01)。
　　结论:
　　1慢性丙型肝炎患者PBMCs中TIPE2基因的表达水平显著低于健康对照者，接受抗病毒治疗后表达水平升高。
　　2慢性丙型肝炎患者PBMCs中FOXP3、CTLA-4基因的表达水平显著高于健康对照者，抗病毒治疗后表达水平下降。
　　3 TIPE2基因表达水平影响肝细胞坏死和炎症程度以及丙肝病毒复制。
　　4 TIPE2、FOXP3、CTLA-4可能通过调节CD4+CD25+Treg细胞的免疫功能参与了慢性丙型肝炎的发病过程。
　　5以上结果提示TIPE2基因通过负性调控免疫反应参与慢性丙型肝炎的发病过程及病程演变的过程。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 临床资料分析

2 慢性丙型肝炎患者PBMCs中TIPE2基因的表达下降

3 慢性丙型肝炎患者PBMCs中FOXP3基因的表达升高

4 慢性丙型肝炎患者PBMCs中CTLA-4基因的表达升高

5 TIPE2基因的表达与慢性丙型肝炎临床指标的相关性

6 慢性丙型肝炎患者PBMCs中TIPE2的表达与FOXP3、CTLA-4的表达呈负相关

附图

附表

讨论

1 TIPE2的特征及作用机制

2 TIPE2 mRNA在慢性丙型肝炎患者PBMCs中的表达、与抗病毒治疗的关系及与慢性丙型肝炎临床指标的相关性

3 慢性丙型肝炎患者TIPE2 mRNA与CD4+CD25+Treg的关系及临床意义

4．慢性丙型肝炎患者PBMCs中TIPE2的表达与FOXP3、CTLA-4 mRNA表达的关系

结论

参考文献

综述 TIPE2在炎症、肿瘤及免疫性疾病中的研究进展

致谢

个人简历