双膦酸盐类药物CP对胃癌细胞生长的影响及机制研究

摘要

目的:胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，流行病学调查显示，目前胃癌的发病率虽呈下降的趋势，但其预后情况仍不容乐观，全球范围内的五年生存率仍低于24％。对于局部进展期和晚期胃癌来讲，化疗仍是治疗的主要手段。多年来胃癌的化疗似乎进入“瓶颈”阶段，目前氟尿嘧啶类和铂类药物仍然是胃癌化疗的基础，联合蒽环类还是紫杉类尚有争议，因此为降低胃癌死亡率或延长胃癌患者生存期，探索低毒、有效的拮抗胃癌的新药是当前研究的重点与热点。
　　双膦酸盐类药物一般用于治疗各种原因所致的骨吸收性疾病。目前临床前研究表明，双膦酸盐类药物具有直接及间接抗肿瘤作用;临床研究则证实伴有骨转移的肿瘤病人应用双膦酸盐，可使病人从中明显获益。在对多发性骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤的研究中发现双膦酸盐类药物确实具有直接抗肿瘤效应，其主要是通过抑制肿瘤增殖和诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用的。以往的研究表明，由于结构上的不同，不同的双膦酸盐类药物的抗肿瘤效应亦不相同。在体外，其抑制肿瘤细胞增殖的作用强度是由其侧链基团所决定的，其R2侧链越为复杂，则其抗肿瘤效应越强。但有关双膦酸盐类药物抗肿瘤的细胞内信号途径目前不完全清楚，且其对胃癌的抗肿瘤研究少见报道。
　　细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signalregulated kinase1/2，ERK1/2)是广泛存在于真核细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成员。ERK1/2信号通路被激活后，可以对细胞内的底物蛋白或转录因子发挥作用，引起底物蛋白活化和转录增强，从而调控细胞的增殪、分化、凋亡等。以往的研究表明，ERK1/2信号通路可以通过线粒体及死亡受体细胞凋亡途径发挥对凋亡的调控作用。ERK1/2信号通路参与多种药物诱导的细胞凋亡，其亦有可能参与双膦酸盐类药物诱导的细胞凋亡，有关ERK1/2信号通路是否参与双膦酸盐类药物诱导的胃癌细胞凋亡，目前尚未见报道。
　　本实验，我们对新合成的双膦酸盐类药物CP进行研究，其化学名称为[2-（6-氨基-嘌呤-9-基）-1-羟基-膦酰乙基]膦酸，在化学结构上，除了含氮之外，其R2侧链增加了腺嘌呤，结构相对复杂（见Fig.1.1）。在体外，应用CP对胃癌SGC-7901细胞进行干预;并构建裸鼠胃癌移植瘤，应用CP进行体内研究，分析ERK1/2信号通路蛋白的表达变化与细胞凋亡之间的关系，以探讨ERK1/2信号通路与双膦酸盐类药物CP抗胃癌作用间的关系，揭示其细胞内信号转导机制，为双膦酸盐类药物在胃癌化学治疗中提供新的理论和实验依据。
　　方法:
　　1、双膦酸盐类药物CP对胃癌细胞生长影响的研究。
　　培养人胃癌细胞株(SGC-7901、BGC-823、MKN-45和MKN-28)和人结肠癌细胞株(Lovo、HT-29)以不同浓度的CP（20，40，80，160μmol/L）作用于细胞，采用MTT法观察CP对细胞生长的影响，并计算CP的半数抑制浓度(IC50)。对胃癌SGC-7901细胞进行药物CP干预实验，MTT法观察不同作用时间点（0、1、3、6、12和24h），不同药物浓度(10、20、40和80μmol/L)对细胞生长的影响。流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测CP对细胞周期及凋亡的影响，酶联免疫法（ELISA法）检测细胞凋亡的DNA片断，Westem blot检测CP对SGC-7901细胞Bcl-2、Bax、Bad、caspase-3、caspase-9、PARP蛋白表达的影响，进一步凋亡酶活性分析CP作用后caspase-3、caspase-9活性的变化，观察CP在体外抑制胃癌细胞增殖及诱导凋亡中的作用。
　　2、双膦酸盐类药物CP对胃癌细胞ERK1/2信号通路影响的研究。
　　应用40μmol/L的CP对胃癌SGC-7901细胞进行干预，Western blot检测CP作用不同时间（0、0.5、1、3、6、12和24h），细胞中ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK、MEK、p-MEK、Raf-1、p-Raf-1蛋白的表达水平。RT-PCR法检测ERK1/2 mRNA水平。应用ERK1/2通路抑制剂PD98059及ERK1/2干扰RNA对细胞进行干预，将实验细胞分为8组:CP(40μmol/L)组;PD98059（20μmol/L）组;CP（40μmol/L）+PD98059(20μmol/L)组;ERK1/2 siRNA(25nmol/L)组;control siRNA(25nmol/L)组;CP(40μmol/L)+control siRNA(25nmol/L)组;CP（40μmol/L）+ERK1/2 siRNA（25nmol/L）组;对照组。MTT法检测各组细胞增殖活力;FCM检测各组sub-G1期细胞百分比;凋亡酶活性分析，测定各组caspase-9活性;western blot分析各组PARP、cleaved PARP、ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达水平。最终探讨ERK1/2通路与CP抑制胃癌细胞增殖及诱导凋亡之间的关系。
　　3、双膦酸盐类药物CP对人胃癌裸鼠移植瘤生长的影响及机制研究。
　　将人胃癌SGC-7901细胞接种于12只BABL/C/nu/nu裸鼠（4周龄，雌性，15-17g）左侧腋窝皮下（细胞数2×106/部位），构建胃癌裸鼠移植瘤模型，将裸鼠随机分为2组，对照组及CP组，每组6只。接种后第5天开始，每日腹腔注射0.16％碳酸氢钠溶液及CP(200μg/kg/day，浓度为1mmol/L)至第30天，每周秤量裸鼠体重2次，每3天测量移植瘤的最长径及最短径，计算肿瘤体积并同时绘制肿瘤生长曲线，体积按公式V=ab2/2计算（a，b分别为肿瘤的最长径、最短径）。第30天处死裸鼠，取瘤体及裸鼠脏器，秤瘤重。免疫组织化学检测PCNA及Ki67在移植瘤中的表达，TUNEL法检测裸鼠移植瘤中细胞凋亡情况，Western blot ECL法检测移植瘤ERK1/2、pERK1/2、JNK、pJNK、p38、p-p38蛋白表达变化，HE染色后，光镜下观察移植瘤及裸鼠肝、肾脏器的改变。
　　结果:
　　1、双膦酸盐类药物CP对胃癌细胞生长影响的研究。
　　1.1 MTT法测定胃癌细胞生长抑制。用MTT法观察CP对胃癌及结肠癌细胞生长的抑制率，计算CP的半数抑制浓度为40μmol/L。用10～80μmol/LCP作用于胃癌SGC-7901、MKN-28、BGC-823细胞株1、3、6、12和24h后，可抑制胃癌细胞的生长，并呈时间和浓度依赖性，CP作用后对胃癌正常粘膜细胞GES-1无抑制作用。
　　1.2流式细胞术测定细胞凋亡和细胞周期。40μmol/L CP作用0、6、12、24h后能诱导胃癌SGC-7901细胞发生凋亡，在流式DNA组方图上表现为亚G1峰的出现，其出现于G0/G1峰前，此峰代表细胞凋亡。并呈时间依赖性改变细胞周期的分布，使G1期细胞、S期细胞比例降低,sub-G1期、G2/M期细胞比例增高。AnnexinⅤ/PI双染法流式细胞术分析显示:随时间延长，AnnexinⅤ阳性/PI阴性细胞逐渐增多，具有时效关系。
　　1.3 ELISA法检测细胞凋亡的DNA片断。40μmol/L CP作用胃癌SGC-7901细胞0、6、12、24h后，酶联免疫法（ELISA法）检测细胞的DNA片段。随着CP作用时间的延长，可见DNA片段逐渐增多，反映凋亡细胞逐渐增多。
　　1.4 CP对SGC-7901细胞Bcl-2、Bax、Bad、caspase-3、-9、PARP蛋白表达的影响。40μmol/L CP作用SGC-7901细胞0、6、12和24h后，cleavedcaspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP、Bax、Bad表达水平逐渐升高，而Bcl-2蛋白水平逐渐下降，差异有显著性(P＜0.05);Bax/Bcl-2比率逐渐升高。
　　1.5凋亡酶活性分析。胃癌SGC-7901细胞在40μmol/L CP作用0、6、12、24h后，caspase-3、caspase-9的活性呈时间依赖性的增高，(P＜0.05)
　　2、双膦酸盐类药物CP对胃癌细胞ERK1/2信号通路影响的研究。
　　2.1 CP上调胃癌细胞ERK1/2信号通路蛋白的表达。40μmol/L的CP作用胃癌SGC-7901细胞不同时间点(0、0.5、1、3、6、12、24h)，可见p-ERK1/2蛋白表达逐渐增高，其上游相关蛋白p-raf-1，p-MEK1/2蛋白表达亦逐渐增高，而MAPK其他两条p38及JNK蛋白表达无变化。40μmol/L的CP作用胃癌SGC-7901细胞不同时间点(0、6、12、24h)，可见ERK1/2 mRNA水平逐渐增高。
　　2.2 PD98059、ERK1/2 siRNA减弱了CP抑制胃癌细胞增殖的作用。CP、PD98059及ERK1/2 siRNA单独或两者联合作用于胃癌SGC-7901细胞24h后，经MTT分析，CP（40μmol/L）+PD98059（20μmol/L）组和CP（40μmol/L）+ERK1/2 siRNA(25nmol/L)组的细胞活力较单独应用CP（40μmol/L）组增强，可见PD98059及ERK1/2 siRNA削弱了CP抑制胃癌细胞增殖作用。
　　2.3 PD98059、ERK1/2 siRNA抑制了CP诱导胃癌细胞凋亡的作用
　　流式细胞术分析CP处理后的亚二倍体峰期（sub-G1期）胃癌细胞的百分比发现，CP（40μmol/L）+PD98059（20μmol/L）组和CP(40μmol/L)+ ERK1/2 siRNA(25nmol/L)组的sub-G1细胞占比较单独应用CP(40μmol/L)组明显降低，说明PD98059和ERK1/2 siRNA均抑制了CP诱导胃癌细胞凋亡的作用。
　　2.4 CP、PD98059、ERK1/2 siRNA对caspase-9活性及PARP表达的影响。凋亡酶caspase-9活性分析显示，CP（40μmol/L）+PD98059（20μmol/L）组和CP(40μmol/L)+ERK1/2 siRNA(25nmol/L)组的caspase-9活性较CP（40μmol/L）组显著降低。同时western blot分析PARP蛋白表达，PD98059和ERK1/2 siRNA均降低了CP诱导的cleaved PARP蛋白表达水平。
　　2.5 CP、PD98059、ERK1/2 siRNA对ERK1/2蛋白表达的影响。CP(40μmol/L)、PD98059(20μmol/L及ERK1/2 siRNA(25nmol/L)单独或两者联合作用于胃癌SGC-7901细胞24h后，可见PD98059及ERK1/2siRNA部分的抑制了CP对ERK1/2的激活。
　　3、双膦酸盐类药物CP对人胃癌裸鼠移植瘤生长的影响及机制研究。
　　在裸鼠的皮下，应用胃癌SGC-7901细胞，成功构建出人胃癌裸鼠移植瘤模型，成瘤率达100％。和对照组相比，CP组移植瘤的生长速度明显减慢，有统计学差异(P＜0.01)，CP处理组裸鼠移植瘤第9、15、21、27、30天的平均体积分别为51±10.17mm3、254.17±38.78mm3、358.33±43.89mm3、462.5±52.22mm3及595±55.76mm3，对照组的相应平均体积分别为119.83±8.35mm3、299.66±30.81 mm3、646.33±47.50mm3、1101.57±60.47mm3及1298.33±66.16mm3，CP处理组的裸鼠移植瘤瘤体的平均瘤重为0.67±0.09g，显著低于对照组的1.10±0.16g(P＜0.05)。免疫组织化学检测，CP组PCNA和Ki-67在移植瘤组织中的表达，显著低于对照组(P＜0.05）。TUNEL检测显示，与对照组相比，CP组移植瘤的凋亡率增加，两者有显著性差异(P＜0.05)。CP移植瘤组pERK1/2的表达水平较对照组升高，JNK、pJNK、p38、p-p38蛋白的表达无明显改变。光镜下观察两组裸鼠肝、肾也无药物性损害改变。
　　结论:
　　1、双膦酸盐类药物CP呈时间、剂量依赖性的抑制胃癌SGC-7901细胞增殖并诱导凋亡。
　　2、双膦酸盐类药物CP可能通过阻滞细胞周期于G2/M期、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达并上调caspase-3、caspase-9蛋白的表达诱导细胞凋亡，从而抑制胃癌SGC-7901细胞增殖。
　　3、双膦酸盐类药物CP处理可激活ERK1/2信号通路，ERK1/2的磷酸化蛋白表达增高。
　　4、ERK1/2抑制剂PD98059及ERK1/2 siRNA下调CP抑制胃癌细胞生长及诱导凋亡作用。
　　5、双膦酸盐类药物CP可在体内、体外上调ERK1/2信号通路相关蛋白的表达，ERK1/2信号通路可能参与CP诱导的胃癌细胞凋亡。
　　6、双膦酸盐类药物CP在体内抑制人胃癌裸鼠皮下移植瘤的生长，且无明显的药物不良反应，为双膦酸盐类药物用于胃癌的化学治疗提供了理论依据。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 双膦酸盐类药物CP对胃癌细胞生长影响的研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 双膦酸盐类药物CP对胃癌细胞ERK1／2信号通路影响的研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 双膦酸盐药物CP对人胃癌裸鼠移植瘤生长的影响及机制研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 双膦酸盐类药物抗肿瘤作用的研究进展

致谢

个人简历