再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞生物学特性及其对造血的影响的研究

摘要

目的:再生障碍性贫血（简称再障，AA）是儿童常见的难治性血液系统疾病之一，尤其是重型再生障碍性贫血（SAA），脏器出血和严重感染的发生率高。应用抗胸腺细胞球蛋白/抗淋巴细胞球蛋白(ATG/ALG)联合环孢素A(CsA)的强化免疫抑制治疗(IST)方案的推出，使急性再障的早期病死率降低，长期存活率及生存质量与造血干细胞移植(HSCT)相近。然而，无效、疗效延迟出现、复发、日后转变为PNH、MDS和急性白血病等疾病的几率较高和早期死亡仍是IST显著存在的问题。这使得我们应进一步探索再生障碍性贫血的完整病因以获得更为有效的治疗手段。
　　目前普遍认为免疫异常尤其是淋巴细胞免疫功能紊乱在再障的发病中起重要作用。除免疫功能异常外，其他机制如造血微环境缺陷及造血干细胞内在增殖能力受损也有可能参与了再生障碍性贫血的发病过程，越来越多的证据表明造血微环境对造血过程必不可少。
　　骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是构成造血微环境的重要组成成分，骨髓中成骨细胞与脂肪细胞具有同源性，均来源于BMMSCs。红髓脂肪化是再障最具特征性的病理改变之一。主要原因是再障患者骨髓中脂肪细胞明显增多。然而到目前为止，再生障碍性贫血的发病是否与脂肪细胞过度生成或是间充质干细胞功能缺陷有关尚未明确。是否BMMSCs的分化能力发生变化，导致其向成骨、成脂肪分化的平衡失调，从而骨髓中BMMSCs成脂增多，再障患儿出现骨髓脂肪化这一特征性病理改变？我们假设如果BMMSCs发生改变，使其向脂肪细胞的转化增加，那么成骨细胞的生成则会减少，而基于成骨细胞龛在造血中的重要地位，在造血微环境中，BMMSCs及其分化成的细胞对造血的影响及相互关系目前的研究尚未明确。
　　本课题回顾性分析了我院小儿科重型再障(SAA)患儿应用ATG联合联合CsA免疫抑制治疗(IST)取得的临床疗效、不良反应、治疗前后外周血三系及T细胞亚群的变化情况，进一步探讨了IST的患儿造血功能恢复的情况;同时完成SAA患儿BMMSCs的分离培养及纯化，检测AA患儿的BMMSCs在增殖、分化及凋亡等方面的变化，并检测其可能的作用机制，此外，进一步探讨BMMSCs的生物学特性改变对造血的影响，从另一个研究思路探讨AA发病的机制。以指导临床上对不同致病原因的患儿采取不同的治疗方法。
　　方法:
　　1.回顾性分析我院1996年6月-2010年11月收治的应用ATG联合CsA免疫抑制治疗SAA和vSAA患儿24例。所有患儿均给予兔-ATG[4-5mg/(kg·d)×5]，同时给予CsA口服，初始剂量3-5 mg/（kg·d）。治疗前清除感染灶，积极防治过敏反应，密切观察治疗前后临床表现的改善及血常规的恢复规律，以及用药期间的不良反应反射率等情况。
　　2.分离培养扩增AA患儿的BMMSCs:以正常人作为对照组，观察AA患儿BMMSCs的原代细胞培养及扩增传代的特点。
　　3.选取生长状态良好的P3代细胞，瑞氏吉姆萨染色后固定，显微镜下比较AA患儿和正常人BMMSCs的形态差别。
　　4. MTT法测定AA患儿BMMSCs生长曲线。
　　5.加入分化诱导液对比AA患儿和正常人BMMSCs成脂分化能力的差异。
　　6.RT-PCR和免疫组织化学方法比较AA患儿与正常人BMMSCs成脂分化的标志基因PPAR2基因水平及蛋白水平的表达情况，了解有无差异。
　　7.建立BMMSCs与K562细胞的共培养体系，直接计数法和MTT法检测BMMSCs对K562细胞增殖的影响。
　　8.Hoechest33342染色方法和应用透射电镜进一步观察比较AA患儿与正常人BMMSCs的形态及结构差异。
　　结果:
　　1.24例患儿免疫抑制治疗的总有效率为66.7％，起效时间3-7个月。应用ATG主要不良反应为过敏、血清病和感染，发病率分别为83.3％、54.1％和70.8％，无被迫停药病例。3例死亡，2例死于ATG治疗后1个月内发生的严重败血症，1例死于ATG治疗后2个月发生的脑出血。疗效相关统计分析显示，从确诊再障到接受ATG治疗，病程≤6个月者有效率明显高于病程＞6个月者，两组总有效率分别为92.3％和50％(P＜0.05);ATG治疗后，淋巴细胞绝对值(ALC)下降幅度＞2×109/L者的有效率明显高于下降幅度≤2×109/L者，两组总有效率分别为92.3％和50％（P＜0.05）;患儿的性别、年龄、疾病严重程度、是否发生血清病以及T细胞亚群（CD4/CD8比值）均与疗效无关。随访过程中未见PNH、MDS及急性白血病等克隆性疾病发生。
　　2.AA患者骨髓中脂肪细胞增多，造血细胞明显减少。
　　3.AA患儿BMMSCs生长缓慢，克隆形成较少，贴壁及融合时间更长。在传代到P3代之后，细胞增殖能力增强，经瑞吉染色，发现细胞细胞形态均一，呈纤维状生长，旋涡状排列，胞体较小，细胞核致密。AA患者与正常对照组BMMSCs在光镜下的形态基本无差异。
　　4..AA患者的BMMSCs的增殖能力远弱于正常对照组。
　　5.与正常对照相比，再障患儿BMMSCs体外培养具有更强的易成脂性(78.6％±4.1％ vs0％)(P＜0.001)。
　　6.再障患儿的脂肪细胞生成调控因子PPARγ2的mRNA表达水平（3.13±0.02）显著高于正常对照组(2.80±0.31)，差异有统计学意义(P=0.025);蛋白水平一致。
　　7.BMMSCs对K562细胞增殖的影响:
　　为了探讨BMMSCs分化异常对细胞增殖的影响，我们选取未出现明显脂肪细胞分化的生长状态良好的BMMSCs，经含成脂诱导液培养后油红O证实细胞转化为脂肪细胞，建立支持细胞模型。加入K562细胞共培养，经MTT检测，结果显示，K562细胞在脂肪诱导分化剂培养的BMMSCs上的生长速度（0.651±0.06）明显低于在正常MSC上的增殖速度（0.879±0.03），差异有统计学意义(P＜0.001)，两组K562细胞的生长速度均高于正常对照（0.533±0.05，P＜0.001）。
　　8.Hoschest染色结果显示正常对照组与观察组均未发现有明显凋亡现象。
　　9.经电子显微镜观察，再障患者和正常对照组之间相比，核内部结构未发现明显区别，但从胞浆成分看，在正常对照组中核周及细胞膜之间充斥着大量线粒体及囊泡样结构，聚集成片，而在再障患者细胞中，其数量相对较少。
　　结论:
　　1.ATG联合CsA的免疫抑制治疗是儿童SAA和vSAA的有效疗法，再障的病程及治疗过程中ALC的下降程度可能与免疫抑制治疗的疗效有关，治疗过程中需积极预防和控制ATG不良反应，避免治疗相关死亡。
　　2.第二部分的研究我们发现再障患者的骨髓基质干细胞在脂肪细胞能力方面明显增强。随后的研究发现患者基质干细胞中PPAR-gamma的表达明显增强，无论在基因水平还是蛋白水平都得到了验证。从而提示再障患者骨髓的基质干细胞在脂肪转化能力增强是基因表达变化所致。进而在一定程度上解释了再障患者骨髓脂肪化的原因。
　　3.BMMSCs细胞向脂肪细胞分化后，作为滋养细胞，对上层细胞的支持能力明显下降，提示骨髓脂肪化会降低对干细胞的支持功能。从核酸染色及电镜结果看，这种支持功能的下降，有可能和患者基质细胞胞浆细胞器的变化影响了细胞的功能状态，导致细胞因子分泌发生变化有关。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 ATG联合CSA免疫抑制治疗儿童重型再生障碍性贫血的研究

前言

材料与方法

结果

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 再障患儿骨髓间充质干细胞生物学特性改变对抑造血影响的研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述 获得性再生障碍性贫血的免疫异常与造血干细胞缺陷

致谢

个人简历