P-p38MAPK在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠发病不同时期脊髓组织的表达及SB203580保护机制的研究

摘要

目的:多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种以中枢神经系统白质脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病。具有反复发作与缓解、每况愈下的临床特点，为青年人中最常见的神经系统疾病之一。目前，同其他大多数自身免疫性疾病类似，MS的病因及发病机制尚无定论，通常认为MS发病是个体遗传易感倾向与环境因素共同作用的结果。其发病具体涉及免疫炎症、氧化应激等多种机制。其中CD4+T细胞介导的免疫炎症在致病过程中起到重要作用。CD4+T细胞具有多种亚型，包括Th1细胞，Th2细胞，Th17细胞。其中以分泌IL-17为特征性细胞因子的Th17细胞在其发病及病程进展中起到至关重要的作用。近年来研究发现，一个新的信号通路p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路可以作用于Th17细胞分化的调控而受到极大的关注。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)为细胞内的重要信号传递者。p38 MAPK是MAPK家族中的重要组成部分，其主要在细胞应激和炎症刺激时被磷酸化激活，激活后的形式为p-p38MAPK。
　　本实验通过对p38MAPK、p-p38MAPK(p38MAPK激活形式)及IL-17在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠发病初期、高峰期、缓解期，于腰膨大处脊髓组织中动态表达的研究，探讨p38MAPK在EAE中可能的致病机制。
　　并且，本实验进一步应用SB203580药物对EAE小鼠进行干预，SB203580是一种常用的p38MAPK抑制剂，其可以选择性抑制中枢神经系统内CD4+T细胞中表达的主要p38MAPK亚型(p38α和p38βMAPK亚型)的磷酸化激活过程。应用SB203580后，对小鼠EAE发病高峰期时的发病率、EAE严重程度、体重变化情况以及上述指标表达水平的变化的研究，初步探索SB203580对MS动物模型EAE小鼠的保护作用及其可能机制，为进一步探讨多发性硬化的致病机制及治疗靶点提供有具有实际意义的实验基础。
　　方法:将80只C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、EAE初期组、EAE高峰期组、EAE缓解期组和SB203580组，每组16只。将EAE初期组、EAE高峰期组、EAE缓解期组和SB203580组以MOG35-55为抗原免疫C57BL/6小鼠建立EAE致病模型。自免疫当天，SB203580组小鼠给予干预药物SB203580以0.2mg/kg的计量每日腹腔注射，其余组小鼠均只给予等剂量的药物溶剂二甲基亚砜(DMSO)每日腹腔注射，观察小鼠的体重变化、发病情况及神经功能缺损评分。EAE初期组在EAE发病初期，即免疫后第13天留取标本;EAE高峰期组和SB203580组小鼠在EAE高峰期，即免疫后第20天留取标本;EAE缓解期组在EAE的缓解期，即免疫后第30天留取标本。于上述相应时期，留取各组小鼠腰膨大处组织进行灌注取材，以HE染色观察其炎症细胞浸润程度，以沙尔坚牢蓝染色观察其脱髓鞘情况;于上述相应时期留取各组小鼠腰膨大处组织进行新鲜取材用于western blot技术检测p38MAPK、p-p38MAPK及IL-17蛋白表达情况。
　　结果:
　　1、空白对照组、EAE高峰期组、SB203580组小鼠高峰期发病率相比:空白对照组小鼠始终未发病。SB203580组小鼠EAE的发病率较EAE高峰期组小鼠显著降低（P＜0.05）。
　　2、空白对照组、EAE高峰期组、SB203580组小鼠高峰期神经功能缺损评分相比:空白对照组小鼠神经功能缺损评分为0。SB203580组小鼠神经功能缺损评分同EAE高峰期组小鼠相比明显下降(P＜0.05)。
　　3、空白对照组、EAE高峰期组、SB203580组小鼠高峰期体重均数相比:EAE高峰期组及SB203580组小鼠体重出现不同程度减轻(P＜0.05)。其中EAE高峰期组较SB203580组小鼠体重减轻程度更加明显(P＜0.05)。
　　4、EAE初期组、EAE高峰期组、EAE缓解期组与空白对照组相比，腰膨大处脊髓组织白质内出现不同程度炎性细胞浸润及脱髓鞘;EAE高峰期组同EAE初期组及缓解期组相比，其炎性病灶数目及脱髓鞘严重程度和区域增多更为明显;SB203580组同EAE高峰期组相比，其炎性病灶及脱髓鞘严重程度和区域有所缩小。
　　5、空白对照组、EAE初期组、EAE高峰期组、EAE缓解期组相比:p38MAPK在各组小鼠脊髓组织腰膨大处表达情况无明显差异。而p-p38MAPK在EAE高峰期及EAE缓解期蛋白表达含量较空白对照组及EAE初期组明显上升(P＜0.05)。IL-17在EAE高峰期组表达，与其他各组相比明显表达增多(P＜0.05)。
　　6、空白对照组、EAE高峰期组、SB203580组相比:p38MAPK在各组中的表达无明显差异。p-p38MAPK、IL-17在SB203580组小鼠腰膨大处脊髓组织表达含量较EAE高峰期组相比表达下降（P＜0.05）。
　　结论:
　　1、P38MAPK可以通过Th17细胞介导的免疫炎症机制参与小鼠EAE的发病。
　　2、SB203580可以降低EAE小鼠的发病率、减轻发病时体重损失、神经功能损伤的程度以及脊髓内炎性细胞浸润和白质脱髓鞘的程度。
　　3、SB203580作用的机制可能是通过抑制P38MAPK磷酸化激活，进而减轻EAE发病中的Th17细胞介导的免疫炎症损伤从而发挥保护作用。

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材料与方法

3 结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 p38 MAPK在多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用

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