注射用丹参多酚酸通过JAK2/STAT3信号通路促进脑缺血小鼠血管生成及改善行为功能

摘要

目的:脑缺血后血管生成有助于神经血管网络重塑，促进脑缺血后行为功能改善。注射用丹参多酚酸是中药丹参中水溶性成分，其主要成分是丹酚酸B。有报道证实丹参多酚酸可以促进心肌缺血后血管生成。JAK2/STAT3信号通路即:两面神激酶/信号传导及转录激活因子信号通路，广泛参与血管生成及细胞的增殖、分化和凋亡等许多重要的生物学过程。
　　本实验旨在研究注射用丹参多酚酸对脑缺血小鼠血管生成作用及行为功能的影响，并探讨其促进血管生成的作用机制。应用雄性C57BL/6小鼠电烧灼法大脑中动脉闭塞(permanent distal middle cerebral arteryocclusion，dMCAO)致局灶性脑缺血模型，连续给予注射用丹参多酚酸治疗14天观察脑缺血后血管生成情况，评价其行为功能，并研究注射用丹参多酚酸对pJAK2、pSTAT3及血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)、血管生成素(angiopoietins，Angs)表达的影响。
　　方法:雄性C57BL/6小鼠(年龄2-3月，体重25-30 g)。电烧灼法建立右侧dMCAO模型。药物干预组动物于脑缺血后24小时开始连续14天腹腔注射注射用丹参多酚酸。Sham组和dMCAO组腹腔注射等量生理盐水。实验分为三部分。
　　实验一:观察注射用丹参多酚酸对脑缺血小鼠行为功能及脑梗死体积的影响。实验动物随机分为dMCAO组（dMCAO+生理盐水）、注射用丹参多酚酸大剂量组(dMCAO+Sals30 mg/kg，Sals-H)、注射用丹参多酚酸小剂量组(dMCAO+Sals10 mg/kg，Sals-L)。分别于脑缺血后1、7、14、28天采用Rota-Rod test、Modified neurologic severity scores(mNSS)两种神经功能评分法评价其行为功能，采用HE染色测定脑梗死体积。
　　实验二:评价注射用丹参多酚酸对脑缺血小鼠血管生成作用。实验动物随机分为Sham组（Sham+生理盐水）、dMCAO组（dMCAO+生理盐水）、注射用丹参多酚酸大剂量组(dMCAO+Sals30 mg/kg，Sals-H)。分别于脑缺血后7、14、28天采用激光共聚焦技术测定微血管密度、内皮细胞增殖及周细胞、星形胶质细胞包裹率。分别于脑缺血后7天、14天用伊文斯兰染色法测定新生血管通透性。
　　实验三:探讨注射用丹参多酚酸促进脑缺血小鼠血管生成作用机制。实验动物随机分为Sham组（Sham+生理盐水）、dMCAO组(dMCAO+生理盐水)、注射用丹参多酚酸大剂量组(dMCAO+Sals30 mg/kg，Sals-H)。分别于脑缺血后3、7、14天用Western blot测定pJAK2、pSTAT3及VEGF、Ang-1、Ang-2的表达水平。
　　结果:
　　1、注射用丹参多酚酸改善行为功能评分，不影响恢复期脑梗死体积
　　脑缺血后后1、7、14、28天应用Rota-Rodtest、mNSS两种神经功能评分法评价其行为功能。脑缺血后1天各组行为学评分处于平衡基线水平，7天药物干预组较dMACO组改善，但无明显差异（P＞0.1）。14天开始直至28天，Sals-H组的神经功能评分较dMCAO组及Sals-L组显著改善(P＜0.05)。Sals-L组与dMCAO组神经功能评分无明显差异(P＞0.1)。脑梗死体积显示3组之间无明显差异（P＞0.1）(Fig.1)。
　　2、注射用丹参多酚酸促进脑缺血后血管生成
　　脑缺血14天后，Sals-H组的微血管密度较dMCAO组及Sham组显著增加，（Sals-H组vs.dMCAO组和Sham组:13.14％±0.60％ vs.11.12％±0.38％和7.06％±0.27％，P＜0.01）。脑缺血28天后，同样Sals-H组的微血管密度显著增加（Sals-H组vs.dMCAO组和Sham组:14.70％±0.34％vs.10.46％±0.24％和7.74％±0.29％，P＜0.01）。而脑缺血7天后，三组间微血管密度没有明显差异（Sals-H组vs.dMCAO组和Sham组:11.90％±0.16％ vs.11.25％±0.33％和8.25％±0.13％，P＞0.1）。同微血管密度相一致，Sals-H组BrdU/CD31阳性细胞数于缺血后14天较dMCAO组及Sham组显著增加(Sals-H组vs.dMCAO组:16.08％±0.50％ vs.8.47％±0.39％,P＜0.01)(Fig.2A,2B,2E)。
　　脑缺血后7天，Sals-H组病变侧脑组织伊文斯兰含量较dMCAO组明显增加(P＜0.05)，而于缺血后14天，Sals-H组病变侧脑组织伊文斯兰含量与dMCAO组无明显差异(P＞0.1)(Fig.2C，2D)。
　　3、注射用丹参多酚酸促进脑缺血后周细胞增殖、募集及增加微血管周细胞包裹率
　　脑缺血14天至28天，Sals-H组微血管周细胞包裹率较dMCAO组及Sham组显著增加（14天Sals-H组vs.dMCAO组和Sham组:69.88％±1.05％ vs.56.42％±1.09％和43.08％±1.18％,28天Sals-H组vs.dMCAO组和Sham组:82.35％±1.42％ vs.64.66％±2.01％和41.29％±1.12％，P＜0.01)。周细胞突起开始明显变长，脚板向内皮细胞延伸，梗死灶周围周细胞数增加，且可以发现与BrdU共标的周细胞（Fig.3）。
　　4、注射用丹参多酚酸增加脑缺血后微血管星形胶质细胞包裹率
　　从脑缺血后7天开始，星形胶质细胞突触开始向微血管延伸，缺血后14天，Sals-H组微血管星形胶质细胞包裹率较dMCAO组及Sham组显著增加（Sals-H组vs.dMCAO组和Sham组:84.20％±0.85％ vs.70.20％±0.80％和38.80％±0.64％，P＜0.01）。于28天达高峰（Sals-H组vs.dMCAO组和Sham组:91.92％±1.31％ vs.67.09％±1.49％和34.72％±1.22％，P＜0.01）。结果显示:Sals-H组GFAP/BrdU阳性细胞数较dMCAO组及Sham组增加(Fig.4)。
　　5、注射用丹参多酚酸促进pJAK2、pSTAT3表达，并调节血管生长因子VEGF、Ang-1、Ang-2的表达
　　Western blot显示，脑缺血后Sals-H组3、7、14天pJAK2、pSTAT3蛋白表达较dMCAO组及Sham组显著增加(P＜0.05)。我们进一步检测注射用丹参多酚酸对血管生长因子VEGF及Ang-1、Ang-2表达的影响。结果显示:脑缺血后3天，Sals-H组VEGF蛋白水平较dMCAO组及Sham组明显增加，一直持续到14天。而Ang-1、Ang-2从7天开始有显著差异(P＜0.05)(Fig.5)。
　　结论:
　　注射用丹参多酚酸促进脑缺血后血管生成，改善小鼠神经功能评分。其机制可能与其通过JAK2/STAT3信号通路调节血管生长因子VEGF、Ang-1、Ang-2有关。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 实验动物与分组

3 动物模型的建立

4 给药方式

5 行为学评估

6 脑梗死体积百分比测定

7 免疫荧光染色

8 血脑屏障通透性测定

9 Western Blot

10 统计学处理

结果

1 注射用丹参多酚酸改善行为功能评分，不影响恢复期脑梗死体积

2 注射用丹参多酚酸促进脑缺血后血管生成

3 注射用丹参多酚酸促进脑缺血后周细胞增殖、募集及增加微血管周细胞包裹率

4 注射用丹参多酚酸增加脑缺血后星形胶质细胞微血管包裹率

5 注射用丹参多酚酸促进pJAK2、pSTAT3表达，并调节血管生长因子VEGF、Ang-1、Ang-2的表达

附图

讨论

结论

参考文献

综述 血管生长因子在脑缺血中的作用

致谢

个人简历