NASH小鼠肠黏膜屏障的变化及布拉氏酵母菌对其作用机制的初步探讨

摘要

近年来，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）逐渐成为欧美发达国家最主要肝病。流行病学研究表明，在世界范围内有10％-50％的人群肝脏出现脂肪变性[1]。其中一部分患者会进一步发展为非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化，有的甚至最终发展为肝硬化、肝细胞癌[2]。据预测，仅需10年左右的时间，NAFLD将有可能成为终末期肝病和肝移植的首要病因。在过去的20年里，尽管对于NAFLD患病率和死亡率的结果仍存在争议[3]，现在公认它是引起非酒精性肝硬化（之前常常被认为由不明原因引起）的主要原因[4]。NAFLD是一种慢性肝病，常表现为一系列代谢综合征，如肥胖、高血糖、高血压、血脂异常、高尿酸、高脂肪肝发生率和高胰岛素血症等[5-8]。目前认为其病理生理机制系多因素参与，但仍尚不明确。
　　越来越多的证据表明，肠-肝轴功能失调是NAFLD发生发展的一个重要因素。小肠细菌过度生长、肠道功能失调、肠黏膜通透性增加等都与NAFLD有着重要联系。正常情况下机体肠道每天会接触大量的细菌和内毒素(Lipopolysaccharide，LPS)，完整的肠黏膜屏障可以阻止其进入机体。当肠道菌群紊乱、肠黏膜屏障功能受损，肠道通透性增加，细菌可以透过肠黏膜屏障，发生移位进入血液循环，形成肠源性内毒素血症。再通过激活肝脏枯否细胞，介导LPS-CD14-TLR4信号通路发挥作用。LPS不仅可以直接损害肝脏，而且可以诱导大量TNF-α、IL-6等细胞因子及炎症介质的表达，从而放大内毒素的作用，进一步加重肝脏和肠黏膜损伤，形成恶性循环。肠黏膜屏障功能在肠-肝轴中起了至关重要的作用。
　　人体肠道内含有大量微生物，一些细菌微生物与人体形成共生关系。益生菌常常被定义为活的微生物，适当摄入对健康有益。研究发现，益生菌不仅可以预防和治疗多种胃肠道疾病，而且对不同原因导致的肝脏疾病也产生有益影响。近年来研究者们针对益生菌通过肠-肝轴发挥有利作用的机制进行了大量研究，发现可能与调节肠道微生物组成和抑菌因子的分泌、改善肠上皮的通透性、调节局部及全身免疫功能等方面有关，但其确切的作用机制尚需进一步研究。布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)是目前临床上使用的唯一的真菌类益生菌制剂，口服后不会被胃酸、胆汁和抗生素破坏，并能够通过分泌一些短肽蛋白中和、降解细菌毒素，对肠道菌群具有调节作用。
　　目的:建立高脂饮食的NASH小鼠动物模型，检测小鼠内毒素水平，肠黏膜屏障变化情况，初步探讨肠黏膜屏障在非酒精脂肪性肝病发病中的作用机制;予布拉氏酵母菌散剂灌胃进行干预，观察通过改善肠道菌群，降低内毒素血症后，其肠黏膜屏障和炎症的变化，初步探讨该药物在NASH中可能的治疗作用及其相关作用机制。
　　方法:①动物模型的制备:将6-8周龄的C57BL/6雄性小鼠适应性喂养1周后称重标记，应用随机数字表随机分为正常对照组(NG，n=16)、模型组(MG，n=22)。NG组给予普通对照饮食、MG组给予高脂饮食。于33周末随机处死各组5只动物，进行肝脏H&E染色，组织病理学改变，证实了NASH模型成功。造模成功后从MG组随机选出12只小鼠，再随机分为布拉氏酵母菌灌胃组(TB，n=6)和灌胃对照组(TD，n=6)，予高脂饮食。同时继续饲养正常对照组和模型组剩余小鼠。TB组开始给予布拉氏酵母菌灌胃，按照460mg/kg灌胃，每只小鼠灌胃量为0.5ml，每天1次[9]。TD组同时开始给予布拉氏酵母菌相应辅料（果糖、乳糖）溶解于等量生理盐水灌胃，为期8周治疗，随后处死所有小鼠。②观察小鼠的毛色、活动、进食、饮水和排便等情况，同时每周定时测定小鼠体重，根据体重变化调节灌胃剂量。③处死小鼠后，观察回肠及肝脏情况，留取末端回肠及肝脏组织，称肝脏湿重。④应用全自动生化分析仪进行血清谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶(AST)和甘油三酯(TG)水平的测定;采用鲎试剂法测定血清内毒素水平。⑤H&E染色观察肝脏组织及末端回肠黏膜病理改变。⑥采用免疫组织化学染色方法检测Occludin蛋白、IL-17在各组小鼠回肠末端组织的表达情况。⑦采用Real-time Q-PCR(Real-timequantitation PCR)方法检测各组小鼠回肠组织中Occludin、IL-17A、TNF-α、RORγtmRNA的表达情况。
　　结果:
　　1、各组小鼠体重、肝重指数变化
　　于33周末对部分小鼠处死，肝组织H&E染色，证实小鼠NASH模型复制成功。实验结束后，对各组体重、肝重指数进行比较，33周末时，MG组均较NG组显著增高（体重:42.00±3.13 g vs.28.92±2.62 g，P＜0.05;肝重指数:8.32±0.68 vs.5.20±0.42, P＜0.05），差异有统计学意义。灌胃干预治疗后，TB组分别与MG组、TD组比较均降低（体重:36.02±1.29g vs.42.00±3.13 g,P＜0.05;36.02±1.29 gvs.40.04±2.51 g,P＜0.05;肝重指数:7.24±0.51 vs.8.32±0.68, P＜0.05;7.24±0.51 vs.8.22±0.70, P＜0.05),但仍高于NG组（体重:36.02±1.29 g vs.28.92±2.62 g，P＜0.05;肝重指数:7.24±0.51 vs.5.20±0.42, P＜0.05），有统计学意义;TD组与MG组比较均无明显变化（体重:40.04±2.51 g vs.42.00±3.13 g，P＞0.05;肝重指数8.22±0.70 vs.8.32±0.68,P＞0.05）。说明应用布拉氏酵母菌对高脂饮食诱导的NASH小鼠干预治疗后，小鼠体重会下降;而灌胃对照较前无明显变化。
　　2、血清生化指标变化
　　①与NG组相比，MG组血清ALT、 AST和TG显著升高，差异有统计学意义（ALT:146.89±7.67 U/L vs.24.41±5.56 U/L, P＜0.05; AST:124.96±8.79 U/L vs.53.94±6.34 U/L, P＜0.05; TG:0.80±0.07 mmol/L vs.0.35±0.08 mmol/L, P＜0.05);TB组血清ALT、 AST及TG升高，有统计学意义（ALT:65.70±4.15 U/L vs.24.41±5.56 U/L, P＜0.05;AST:110.18±7.19 U/L vs.53.94±6.34 U/L, P＜0.05; TG:0.50±0.03 mmol/L vs.0.35±0.08 mmol/L, P＜0.05);TD组显著升高（ALT:142.66±8.24 U/L vs.24.41±5.56 U/L, P＜0.05; AST:125.64±0.76 U/L vs.53.94±6.34 U/L, P＜0.05;TG:0.76±0.07 mmol/L vs.0.35±0.08 mmol/L, P＜0.05）;②与MG组相比，TB组ALT、 AST及TG显著降低（ALT:65.70±4.15U/Lvs.146.89±7.67U/L, P＜0.05; AST:110.18±7.19 U/L vs.124.96±8.79 U/L, P＜0.05; TG:0.50±0.03 mmol/L vs.0.80±0.07 mmol/L, P＜0.05）;TD组无明显变化（ALT:142.66±8.24 U/L vs.146.89±7.67 U/L, P＞0.05; AST:125.64±0.76 U/L vs.124.96±8.79 U/L, P＞0.05; TG:0.76±0.07 mmol/L vs.0.80±0.07 mmol/L,P＞0.05）;③与TD组相比，TB组ALT、 AST及TG显著降低(ALT:65.70±4.15 U/L vs.142.66±8.24 U/L, P＜0.05; AST:110.18±7.19 U/L vs.125.64±0.76 U/L, P＜0.05; TG:0.50±0.03 mmol/L vs.0.76±0.07 mmol/L,P＜0.05）。
　　3、血清LPS水平比较
　　MG组与NG组相比，血清LPS显著升高（0.289±0.031 EU/ml vs.0.158±0.005 EU/ml，P＜0.05），差异有统计学意义。灌胃干预治疗后:①TB组血清LPS分别与MG组、TD组相比均降低（0.200±0.029 EU/mlvs.0.289±0.031EU/ml,P＜0.05;0.200±0.029 EU/ml vs.0.288±0.031EU/ml,P＜0.05）;但仍比NG组高(0.200±0.029 EU/ml vs.0.158±0.005 EU/ml，P＜0.05)。②TD组与MG组血清LPS无明显变化(0.288±0.031EU/ml vs.0.289±0.031 EU/ml, P＞0.05)。
　　4、肝脏病理变化
　　肉眼观:NG组小鼠肝脏色泽鲜亮，红褐色，边缘锐利，质地柔软，富有弹性。MG组小鼠肝脏体积弥漫性增大，色泽苍白或带灰黄色，表面光滑，有油腻感，边缘厚而钝，切面呈淡黄或黄红色，欠光泽，刀面脂肪沾染，质稍硬。TB组小鼠肝脏偏黄，质地中等，但与NG组比较颜色仍发浅。TD组与MG组无明显变化。
　　光镜下:NG组小鼠肝小叶结构清晰完整，可见围绕中央静脉呈放射状排列的肝细胞索，肝细胞体积正常，界限清楚，中央可见大而圆的细胞核，胞浆均匀，无脂肪变性及炎性细胞浸润。MG组小鼠肝细胞内均可见充满大量脂肪滴，肝细胞气球样变，可见到程度不等的小叶区或汇管区炎细胞浸润、点状坏死。灌胃干预治疗后，TB组肝脏中央静脉的四周肝细胞结构尚存在，在远离中央静脉的肝细胞尚有轻度脂肪变性，可见炎症细胞浸润减少，与MG组相比，脂肪变性、炎症程度都减轻，但与正常肝脏仍存在差距;TD组与灌胃前后无明显变化。
　　5、回肠病理变化
　　NG组小鼠末端回肠黏膜各层结构基本完整，绒毛排列有序、整齐，不疏松，上皮细胞形态正常，呈高柱状，未见明显黏膜充血水肿，肠腺排列整齐，固有层未见炎性细胞浸润;MG组小鼠末端回肠小肠绒毛稍疏松，部分萎缩，断裂缺损，高矮不一。上皮细胞紧密连接间隙增宽，黏膜上皮细胞坏死脱落，上皮层与固有层分离，部分可见水肿和炎性细胞浸润。应用布拉氏酵母菌治疗后，TB组肠黏膜损伤情况较MG组减轻。TD组与MG组无明显改变。
　　6、Occludin蛋白、IL-17在小鼠回肠末端组织的表达情况
　　Occludin蛋白表达情况:NG组Occludin蛋白均匀一致的分布在肠上皮细胞连接处的顶端，呈线状分布，呈表达很强的棕褐色信号;MG组Occludin蛋白阳性染色明显减弱，连续性降低，分布不均，较NG组表达减少。干预治疗后，TB组较MG组Occludin蛋白表达增强，染色加深，连续性好转。TD组与MG组差异不大。IL-17表达情况:与NG组比较MG组表达增加，干预治疗后TB组表达减少，TD组与MG组无明显变化。
　　7、回肠组织中Occludin、 IL-17A、TNF-α、RORtmRNA的表达情况
　　回肠组织中Occludin mRNA的表达:MG组与NG组比较表达减少，差异有统计学意义(P＜0.05);TB与MG组比较表达增加，但仍低于NG组，差异有统计学意义(P＜0.05);TD组与MG组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。
　　回肠组织中IL-17A、RORγt、TNF-αmRNA的表达:MG组与NG组比较表达升高，差异有统计学意义(P＜0.05);TB与MG组比较表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05);TD组与MG组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。
　　结论:
　　1、高脂饮食可以成功建立小鼠NASH模型，NASH小鼠存在肠源性内毒素血症。
　　2、NASH小鼠肠黏膜上皮紧密连接Occludin蛋白表达减少，机械屏障受损，可能是加重肠源性内毒素血症发生和发展的重要原因。
　　3、NASH小鼠存在肠黏膜免疫屏障损伤，肠黏膜通透性增加，Th17淋巴细胞通路可能参与其免疫应答。
　　4、布拉氏酵母菌可以降低肠源性内毒素血症，改善肝细胞脂肪变和炎症程度，起到治疗NASH的作用。其可能是通过增加紧密连接Occludin蛋白表达，调节肠黏膜免疫应答而发挥作用。

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