55-SNPs个体识别复合分型体系的构建及法医学应用研究

摘要

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。与短串联重复序列STR相比，SNP的突变率低，扩增片段短，在法医亲缘关系鉴定及降解检材分析上更具优势。另外，SNP还能够提供信息推测嫌疑人的遗传背景及预测个体表型特征。SNP常见为二等位基因多态性，因此，为了获得更高的鉴别能力，需要更多的SNP位点联合分析。
　　能够实现在一个体系中同时检测几十个甚至更多的SNP位点，无论对于法医鉴定，还是临床诊断、病原学检测等都是很有意义的。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，是一种体外扩增特定DNA片段的技术，可于短时间内获得数百万特异DNA序列的拷贝。自1985年首创以来，PCR技术凭借其高敏感、高特异、高产率以及快速简便等优点，一直是分子生物学及其相关领域的常用技术。为了获得最大化的PCR产率，反应体系的各组分的浓度、反应时间、温度、循环次数等条件都应有效优化。影响PCR扩增结果的因素很多，用单因素逐个调整优化PCR体系，往往费时费力，可能也得不到稳定的实验结果。而对于多重PCR，多对引物的加入使得酶促反应更加复杂。
　　本研究拟构建55-SNPs检测体系，探索复合PCR扩增体系构建中的科学问题及影响因素，并对其法医学应用价值进行评估。
　　本文主要分三部分展开研究：
　　第一部分 55-SNPs复合分型体系的构建
　　目的:构建稳定的55-SNPs复合分型体系
　　方法:本室前期研究已经构建了一个44Plex SNPs体系，本研究在此基础上，通过增加位点、优化条件，将其扩大为55Plex:
　　1 位点的改变。我们去除了一个在新体系中表现不佳的位点，同时增加了包括位于牙釉质蛋白基因的性别检测位点在内的12个位点。用于个体识别的新增位点来自于Kidd实验室的研究。
　　2 引物设计。新设计了增加的12个SNP位点的扩增及延伸引物，扩增产物片段长度为56-117bp;为了提高PCR扩增效率或消除检测窗内可能干扰分型的杂峰，重新设计了原有体系中4个SNP位点的扩增引物，优先考虑引物的Tm值及扩增产物长度参数;修改了原有体系中的28个延伸引物，其中23个改变了引物的长度，5个改变了靶序列的结合方向。
　　3 反应过程的优化。增加位点数目后，检测过程的五步均进行了优化，涉及反应体系容积、各组分的浓度、退火温度以及循环次数等。
　　第一步，PCR总体积由25μl减小到12.5μl，包括0.5-2ng DNA(QIAampDNA midi试剂盒提取)或者5-20ng DNA（用Chelex-100法提取），1×PCR缓冲液，8mM MgCl2，800μM dNTP，0.009-0.232μM混合扩增引物，1U金酶。扩增条件不变。
　　第二步，通过将1μl SAP(1U/μl)和0.3μl EXOⅠ(10U/μl)加入到2.5μlPCR产物中，去除过量的dNTP和未反应的单链PCR引物。纯化条件37℃孵育1h，80℃变性15min。
　　第三步，SNaPshot反应体系从10μl减小到4.5μl，SBE引物预先混匀并溶于终浓度160mM的硫酸铵中，SBE引物浓度0.090-0.903μM。SBE反应分两个平行的体系进行（29Plex和26Pex）。每一个反应包括2μlSNaPshot mix，1.2μl纯化的PCR产物以及1.3μl混合SBE引物。循环参数:96℃变性10s，58℃退火5s，60℃延伸30s，总共50个循环。
　　第四步，将1μl SAP直接加入到SBE产物中。37℃孵育1h，80℃变性15min灭活酶活性。
　　最后，将1μl纯化好的SBE产物与12μl甲酰胺以及0.2μl GeneScan-120LIZ混匀，3130遗传分析仪电泳检测。
　　结果:成功构建55-SNPs复合分型体系，系统效能高，检测成本低。
　　结论:本部分研究构建了基于SNaPshot方法的55-SNPs复合分型体系，主要经验如下:
　　1 各引物间接近的Tm值以及设计较短的扩增片段，能增加位点的PCR效率。
　　2 多重PCR反应的扩增效率尤为重要，同时可以通过在单碱基延伸反应中避免扩增引物和延伸引物序列相同，来提高特异性。
　　3 增加单碱基延伸反应的循环次数能够增加产物量，提高各位点检测峰值的均衡性，同时不产生非特异性延伸产物。
　　4 改变延伸引物的结合方向有可能缓解同一位点两等位基因的峰高差异。
　　第二部分 规范55-SNPs复合分型体系等位基因命名
　　目的:制定55-SNPs复合分型体系各位点等位基因命名规范。
　　方法:1 按照使用手册定义Kits，Bin sets和Panals。黑色通道和红色通道的最低峰高检出值设定为30RFUs;最小峰高比设定为0.2;其余保留默认参数。
　　2 软件自动标出等位基因，然后对等位基因命名进行人工校正。
　　3 电泳图谱的各参数，包括峰位置和峰高数据导入到Excel中。将所有杂合子分离出来，以计算峰高比。
　　按如上2、3步骤，应用构建的55Plex体系分型470个样本，统计各等位基因峰位置范围和杂合子峰高比。利用这两个参数来制定各位点等位基因命名规范。
　　结果:制定了55Plex复合分型体系详尽的等位基因命名规范。
　　结论:本部分研究通过对470份样本的毛细管电泳分型结果进行数据统计，分析了55-SNPs复合分型体系检测结果的峰高、峰位置参数，并依此制定了等位基因命名原则。结果辨识的统一化、规范化将有助于不同实验者、不同实验室间明确读取分型结果，利于方法的推广。
　　第三部分 55-SNPs复合分型体系的法医学应用评估
　　目的:评估55-SNPs复合分型体系在法医学实践中的应用价值。
　　方法:1 对180份河北汉族人群健康无关个体进行群体遗传学调查，分型55Plex中的SNP位点及26个常用的STR基因座。河北汉族人群54个SNPs的群体遗传学数据与Kidd实验室研究中的176个人群数据进行比较。
　　2 运用复合分型体系对100个“假设父-孩子-母亲”的标准三联体进行分析，评估其在亲缘关系鉴定中的价值。
　　3 通过一系列实验评估体系的灵敏度、种属特异性，以及在混合样本和降解检材分析中的价值。
　　结果:1 54个SNP位点，较低的等位基因频率最小为0.242，最大为0.492，平均0.390，显示在河北汉族人群中较高的多态性。经Bonferroni校正后，54个SNP位点和26个STR基因座间没有观察到明显的连锁不平衡情况（P＜0.05/3160=0.000016），所以这80个基因座间可以应用乘法原则。55Plex体系在河北汉族人群中的随机匹配概率和非父排除率分别为1.327×10-22和0.999932。54个位点的等位基因频率与其它176个人群进行比较，在5021次比较中，3923次表现为没有显著性差异，1098次Fst值的P＜0.05。
　　2 利用55Plex进行三联体亲缘关系鉴定，鉴定结果与STR结果一致。对于不排除父权的73例检案，累积父权指数(CPI)最小为1.64×103，最大为6.39×108，相当于父权相对机会(RCP)最小为0.99939，最大为0.9999999984。在模拟的19000次三联体中，所有无关个体均能被排除，最少1个，最多24个位点不符合孟德尔遗传规律。
　　本研究报道了1例FGA和D10S2325基因座同时出现突变，并存D10S2325稀有等位基因的二联体亲缘关系鉴定。应用26个STR基因座，累积父权指数为4057.5933，未能达到规定的＞10000的标准。而应用55-SNPs体系，所有位点均符合孟德尔遗传定律，累积父权指数达到13115.9826。在本案例中，55Plex成为STR的有效补充。
　　3 构建的复合分型体系最低模板检出量为0.125ng。种属特异性研究表明，仅在恒河猴的样本中检测出15个SNP位点，其它样本在检测区域均无信号峰。两个DNA样本以10∶1，5∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶5和1∶10比例混合时，单从分型图谱中很容易辨认出检测结果可能是混合样本或是发生了污染。当检测陈旧降解检材时，与AmpFlSTR(R) Identifiler Plus相比，检出率更高。
　　结论:本研究构建的55-SNPs体系中所有SNP位点在河北汉族人群中均表现出良好的多态性，其中涉及的SNPs和26个常用的STRs间没有明显的连锁不平衡存在。复合分型体系系统效能高，种属特异性好。同时由于突变率低，扩增片段短，55-SNPs体系在法医学亲缘关系鉴定及降解检材分析中具有一定的优势，当STR不能得出确定的结论或检测失败时，55Plex可以作为其有力补充。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 55-SNPs复合分型体系的构建

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 规范55-SNPs复合分型体系等位基因命名

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 55-SNPs复合分型体系的法医学应用评估

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

附录

综述 应用下一代测序技术检测法医相关SNPs

致谢

个人简历