脂肪酸代谢相关基因多态性与非酒精性脂肪性肝病及其血清脂肪酸变化的关联研究

摘要

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)和遗传易感密切相关。由于尚无有效的治疗方法，NAFLD主要以预防为主。因此，研究NAFLD的易感基因，预测个体NAFLD发病风险，指导高危人群制定合理的膳食对NAFLD的预防具有重要意义。
　　脂肪酸在NAFLD的发生发展过程中起着重要作用，不同种类的脂肪酸具有不同的生理功能，对肝细胞的脂毒性也不相同。NAFLD时体内脂肪酸特别是具有重要生物学意义的n-3和n-6多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的构成比例发生了怎样的改变？哪些种类的脂肪酸为NAFLD的保护性因素？哪些种类的脂肪酸为NAFLD的危险性因素？这些问题值得深入研究。
　　单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)作为第三代遗传多态性标记，广泛存在于人类基因组中。SNP无论发生在基因的编码区还是非编码区，都有可能导致基因的表达差异。脂代谢异常与脂肪酸生物合成和β-氧化分解途径平衡的破坏密切相关，而这两条途径中参与催化反应的关键酶是重要的影响因素。那么编码这些关键酶的基因是否具有NAFLD的SNP易感位点？这些SNP位点是否对会对该基因的表达产生影响？是否与NAFLD状态下脂肪酸组成谱的改变相关呢？
　　本研究以中国北方汉族人群为研究对象，首先采用毛细管气相色谱法检测分析NAFLD人群血清脂肪酸谱的改变，选出与NAFLD关系密切的脂肪酸作为研究的靶点，探讨脂肪酸代谢相关基因的SNP与NAFLD易感性，NAFLD时脂肪酸代谢异常三者之间的关系，以期阐明基因多态性与脂肪酸代谢异常在NAFLD发生发展中的作用，为临床筛选NAFLD高危人群，预测个体发病风险以及制定合理的膳食指导和药物治疗方案提供实验依据和理论基础。
　　第一部分：非酒精性脂肪性肝病人群血清脂肪酸谱及去饱和酶活性分析
　　目的：
　　了解NAFLD患者体内脂肪酸代谢改变情况以及去饱和酶△5D和△6D(PUFAs合成的限速酶)的活性变化，为研究NAFLD时脂肪酸代谢紊乱机制寻找靶点。
　　方法：
　　选择符合条件的研究对象共866例，按照病例对照研究分组(健康人421例，NAFLD患者445例)，测量腰围(waist circumference,WC)、收缩压(systolic blood pressure,SBP)及舒张压(diastolic blood pressure,DBP)，计算体重指数(body mass index,BMI)；收集空腹血清，测定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)、甘油三酯(triglycerides,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、总游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs)及丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、γ-谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyl transpeptidase,GGT)，用高效气相色谱法测定所有受试者空腹血清中主要的14种脂肪酸，先进行单因素分析，再用非条件Logistic回归分析校正混杂因素，分析血清脂肪酸组分变化与NAFLD患病风险的关联性，并用多元线性回归分析血清脂肪酸组分与TG、TC以及HOMA-IR的关联性。
　　结果：
　　1.一般情况及生化指标
　　NAFLD组与健康对照组(Con组)年龄差别无统计学意义(P=0.631)；NAFLD组男性比例高于Con组(42.7％vs33.0%, P=0.003)；与Con组相比，NAFLD组的BMI、WC、SBP、DBP明显高于Con组，P<0.001。
　　与Con组相比，NAFLD组FBG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、GGT均明显增高，HDL-C明显降低，P<0.001；通过公式计算得NAFLD组胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)明显增加，P<0.001。血清总 FFAs明显增加(2.09±0.46 mmol/L vs0.82±0.21 mmol/L)，P<0.001。
　　2.血清脂肪酸组分变化与NAFLD患病风险的关联性
　　与Con组相比，NAFLD组C16:0、C16:1n-7、C18:1n-9、C18:3n-3(α-linolenic acid,ALA)、总单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFAs)及总长链脂肪酸(long-chain fatty acids, LCFAs)百分含量明显增加，校正混杂因素后与NAFLD的患病风险呈正相关，是NAFLD的危险因素，P<0.01。
　　与Con组相比，NAFLD组 C18:0、C20:0、C22:0、C24:0、C18:2n-6(linoleic acid,LA)、C20:4n-6(arachidonic acid, AA)、C22:6n-3(docosahexenoic acid, DHA)、总n-6 PUFAs、总n-3 PUFAs和极长链脂肪酸(very long-chain fatty acids,VLCFAs)的百分含量明显下降，校正混杂因素后与NAFLD的患病风险呈负相关，是NAFLD的保护因素，P<0.01。
　　与Con组相比，NAFLD组C22:4n-6(Docosatetraenoic acid,DTA)百分含量下降，但校正混杂因素后与NAFLD的患病风险无相关性。与Con组相比，NAFLD组 C20:5n-3(eicosapentaenoic acid,EPA)、C22:5n-3(docosapentaenoic acid,DPA)、总饱和脂肪酸（saturated fatty acid,SFAs），总不饱和脂肪酸(unsuaturated fatty acids，UFAs)、SFAs/UFAs和n-6/n-3比值没有明显变化，与NAFLD的患病风险无相关性。
　　用AA/LA和EPA/ALA的比值表示n-6和n-3 PUFAs合成途径△5D和△6D的总活性。与Con组相比，NAFLD组AA/LA和EPA/ALA明显降低，校正混杂因素后与NAFLD的患病风险呈负相关，是NAFLD的保护因素，P<0.01。
　　3.血清脂肪酸组分与血脂以及HOMA-IR的关联性
　　C16:0、C18:1n-9、ALA、总MUFAs、总LCFAs与TG呈正相关，P<0.001；C18:0、LA、C20:0、DTA、DHA、C24:0、总n-6 PUFAs、总n-3 PUFAs、总VLCFAs和EPA/ALA与TG呈负相关，P<0.01。
　　C16:1n-7与TC呈正相关，P<0.001；C18:0、DTA、DHA、总VLCFAs与TC呈负相关，P<0.05。
　　C16:0、C18:1n-9、总MUFAs与HOMA-IR呈正相关，P<0.05；C18:0、LA、总n-6 PUFAs与HOMA-IR呈负相关，P<0.01。
　　小结：
　　1.C16:0、C16:1n-7、C18:1n-9、C18:3n-3(ALA)与NAFLD的患病风险呈正相关，高水平的上述脂肪酸是NAFLD的危险因素；C18:0、C20:0、C22:0、C24:0、C18:2n-6(LA)、C20:4n-6(AA)、C22:6n-3(DHA)与NAFLD的患病风险呈负相关，高水平的上述脂肪酸是NAFLD的保护因素。
　　2.NAFLD人群血清AA和DHA的含量降低与n-6和n-3 PUFAs合成途径去饱和酶总活性下降有关。
　　第二部分：FADS1-FADS2基因多态性与非酒精性脂肪性肝病及其血清PUFAs变化的关联性研究
　　目的：
　　探讨FADS1-FADS2基因簇的单核苷酸多态性与NAFLD患病风险及其血清PUFAs之间的相关性。
　　方法：选择符合条件的研究对象866例(入选和排除标准同第一部分研究)，收集外周血，提取DNA，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)实验平台进行DNA的SNPs分型。先进行单因素分析，再用非条件Logistic回归分析校正混杂因素，分析FADS1-FADS2基因簇的rs174545、rs2072114、rs174602和rs174616四个SNP位点及其构建出的单体型与NAFLD易感性以及NAFLD状态下血清PUFAs和血脂变化的关联。
　　结果：
　　1.FADS1-FADS2基因簇各SNPs位点分型结果
　　河北地区汉族人群中，FADS1基因存在rs174545位点， FADS2基因存在rs2072114、rs174602和rs174616位点。
　　2.FADS1-FADS2基因簇各SNPs位点等位基因频率分析
　　FADS2基因rs174602位点次要等位基因G在NAFLD组的频率(0.184)明显低于Con组(0.235)，携带 rs174602位点次要等位基因 G的个体NAFLD患病风险下降，OR值为0.735(95%CI=0.582-0.927，P=0.009)。与Con组比较，NAFLD组FADS1基因rs174545位点，FADS2基因rs2072114和rs174616位点的等位基因频率差异不明显，均无统计学意义。
　　3.FADS1-FADS2基因簇各SNPs位点基因型与NAFLD发病风险的相关性
　　FADS2基因rs174602位点与NAFLD的易感性存在负相关。在共显性模型下，携带rs174602 AG或rs174602 GG基因型的个体NAFLD的患病风险低于携带rs174602 AA基因型的个体(AG vs AA:OR=0.728,95%CI=0.537-0.986,P=0.041;GG vs AA: OR=0.389,95%CI=0.171-0.885, P=0.024)；在显性模型下，与携带rs174602 AA基因型的个体比较，携带rs174602(AG+GG）基因型的个体发生NAFLD的风险降低，OR值为0.657(95%CI=0.492-0.878，P=0.013)；在隐性模型下，与携带rs174602(AA+AG)基因型的个体比较，携带rs174602 GG基因型的个体发生NAFLD的风险降低，OR值为0.317(95%CI=0.131-0.767,P=0.021)。
　　FADS1基因rs174545位点，FADS2基因rs2072114和rs174616位点与NAFLD的发病风险无关联，在3种分析模型下差异均无统计学意义。
　　4.FADS1-FADS2基因簇各SNPs位点单体型的构建与分析
　　rs174545，rs2072114和rs174602三个SNP位点间分别存在较强的LD(D′>0.5)，构成的MiA单体型GGG与NAFLD的易感性相关，为NAFLD的保护因素(OR=0.702,95%CI=0.519-0.949, P=0.021)，携带MiA单体型GGG的个体NAFLD发病风险较低。其构成的其余5种单体型频率在Con组和NAFLD组中的分布差异不明显，与NAFLD的发病风险无关联。
　　5.rs174602A>G突变对PUFAs和血脂影响的分析
　　按照显性模型分别对Con组和NAFLD组中携带rs174602AA基因型和携带rs174602（AG+GG）基因型的个体血清PUFAs百分含量，AA/LA和EPA/ALA比值以及血脂(TG、TC)的差异进行了分析。结果显示：在Con组中，与携带rs174602 AA基因型的个体比较，携带rs174602(AG+GG)基因型的个体LA升高，P<0.01；AA降低，AA/LA比值降低，P<0.001；在NAFLD组中，与携带rs174602AA基因型的个体比较，携带rs174602(AG+GG)基因型的个体LA、EPA/ALA比值升高，P<0.05；AA、TC降低， AA/LA比值下降，P<0.05。对n-3系PUFAs没有影响。
　　6.FADS1-FADS2基因簇的MiA单体型GGG对PUFAs和血脂影响的分析
　　按照是否携带MiA单体型GGG分别对Con组和NAFLD组中携带MiA单体型GGG的个体和不携带MiA单体型GGG的个体血清PUFAs百分含量，AA/LA和EPA/ALA比值以及血脂(TG、TC)的差异进行了分析。结果显示：在Con组中，与不携带MiA单体型GGG的个体比较，携带MiA单体型GGG的个体LA升高，P<0.05；AA、AA/LA比值降低，P<0.001。在NAFLD组中，与不携带MiA单体型GGG的个体比较，携带MiA单体型GGG的个体LA升高，P<0.05；AA、TC、AA/LA比值降低，P<0.05。
　　小结：
　　1.在中国北方汉族人群中，首次发现FADS2基因的rs174602位点与NAFLD的易感性负相关，rs174602次要等位基因G为NAFLD的保护性因素，并且随着次要等位基因G的积累，个体发生NAFLD的风险逐渐下降。
　　2.在中国北方汉族人群中，首次发现 FADS1-FADS2基因簇由rs174545-rs2072114-rs174602的次要等位基因构成的MiA单体型GGG与NAFLD的易感性负相关，为NAFLD的保护性因素。
　　第三部分：过氧化物酶体脂肪酸β-氧化关键酶基因多态性与非酒精性脂肪性肝病及其血清VLCFAs变化的关联性研究
　　目的：
　　探讨过氧化物酶体脂肪酸β-氧化关键酶(ACOX1、EHHADH、ACAA1、ACOX2、HSD17B4、SCP2)的单核苷酸多态性与 NAFLD患病风险及其血清VLCFAs之间的相关性。
　　方法：
　　选择符合条件的研究对象866例(入选和排除标准同第一部分研究)，收集外周血，提取DNA，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)实验平台进行DNA的SNPs分型。先进行单因素分析，再用非条件Logistic回归分析校正混杂因素，分析6个过氧化物酶体脂肪酸β-氧化关键酶(ACOX1、EHHADH、ACAA1、ACOX2、HSD17B4、SCP2)的17个SNP位点及其构建出的单体型与NAFLD易感性以及NAFLD状态下血清VLCFAs和血脂变化的关联。
　　结果：
　　1.过氧化物酶体脂肪酸β-氧化体系关键酶基因各SNPs位点基因分型结果
　　在河北地区汉族人群中，ACOX1基因存在rs12430、rs7219716和rs8065144位点，EHHADH基因存在rs4687136、rs2160815、rs1509501和rs2284994位点，ACAA1基因存在rs156265和rs2239621位点，ACOX2基因存在rs4317122、rs4681689和rs4387990位点，HSD17B4基因存在rs2075698、rs3756513、rs10064000和rs3797371位点。SCP2基因的rs3766765位点分型失败。
　　2.过氧化物酶体β-氧化体系关键酶基因各SNPs位点等位基因频率分析
　　ACOX1基因rs12430位点次要等位基因T在NAFLD组的频率(0.08)明显低于Con组(0.11)，携带rs12430位点次要等位基因T的个体NAFLD患病风险下降，是携带 rs12430位点主要等位基因 C个体的0.698倍(95%CI=0.505-0.966，P=0.029)。
　　与Con组比较，NAFLD组ACOX1基因rs7219716和rs8065144位点，EHHADH基因rs4687136、rs2160815、rs1509501和rs2284994位点，ACAA1基因rs156265和rs2239621位点，ACOX2基因rs4317122、rs4681689和rs4387990位点以及HSD17B4基因rs2075698、rs3756513、rs10064000和rs3797371位点的等位基因频率差异不明显，均无统计学意义(P>0.05)。
　　3.过氧化物酶体β-氧化体系关键酶基因各SNPs位点基因型与NAFLD发病风险的相关性
　　ACOX1基因rs12430位点与NAFLD的易感性存在相关。在共显性模型下，与携带rs12430主要等位基因纯合子基因型CC的个体比较，携带rs12430 CT基因型的个体NAFLD的患病风险降低(OR=0.696,95%CI=0.489-0.990,P=0.044)；在显性模型下，与携带rs12430 CC基因型的个体比较，携带rs12430(CT+TT)基因型的个体发生 NAFLD的风险降低，OR值为0.575(95%CI=0.340-0.972,P=0.039)。
　　ACAA1基因rs156265位点与NAFLD的易感性存在相关。在共显性模型下，与携带rs156265主要等位基因纯合子基因型CC的个体比较，携带rs156265次要等位基因纯合子基因型GG的个体NAFLD的患病风险升高(OR=1.634,95%CI=1.051-2.541,P=0.029)。在隐性模型下，与携带rs156265(CC+CG)基因型的个体比较，携带rs156265 GG基因型的个体发生NAFLD的风险变化更高，OR值为OR=1.809(95%CI=1.191-2.748,P=0.005)。
　　ACOX1基因的rs7219716和rs8065144，EHHADH基因的rs4687136、rs2160815、rs1509501和rs2284994，ACAA1基因的rs2239621，ACOX2基因的rs4317122、rs4681689和rs4387990，HSD17B4基因的rs2075698、rs3756513、rs10064000和rs3797371共十四个位点与NAFLD的发病风险无关联，在3种分析模型下差异均无统计学意义。
　　4.过氧化物酶体β-氧化体系关键酶基因各SNPs位点单体型的构建与分析
　　ACOX1基因的rs12430、rs7219716和rs8065144三个SNP位点间分别存在较强的LD(D′>0.5)，其构成的单体型CCG在NAFLD组的频率(0.073)明显高于Con组(0.045)，为NAFLD的危险因素(OR=1.639,95%CI=1.086-2.473,P=0.018)，携带单体型CCG的个体NAFLD发病风险增高。其构成的其余4种单体型频率在Con组和NAFLD组中的分布差异不明显，与NAFLD的发病风险无关联。
　　EHHADH基因rs4687136、rs2160815、rs1509501和rs2284994四个SNP位点构建的5种单体型与NAFLD的发病风险无关联。ACAA1基因的rs156265和rs2239621两个SNP位点构建的3种单体型与NAFLD的发病风险无关联。ACOX2基因的rs4317122、rs4681689和rs4387990三个SNP位点构建的6种单体型与NAFLD的发病风险无关联。HSD17B4基因的rs2075698、rs3756513和rs10064000三个位点构建的4种单体型与NAFLD的发病风险无关联。
　　5.rs12430 C>T突变对VLCFAs和血脂影响的分析
　　按照显性模型分别对Con组和NAFLD组中携带rs12430 CC基因型和携带rs12430(CT+TT)基因型的个体血清VLCFAs百分含量及血脂(TG、TC)的差异进行分析，结果显示：在Con组中，与携带rs12430 CC基因型的个体比较，携带rs12430(CT+TT)基因型的个体血清VLCFAs百分含量以及TG、TC变化不明显，差异无统计学意义。在NAFLD组中，与携带rs12430 CC基因型的个体比较，携带rs12430(CT+TT)基因型的个体TC降低，P<0.05；对其他VLCFAs百分含量以及TG没有影响。
　　6.rs156265 C>G突变对VLCFAs和血脂影响的分析
　　按照共显性模型分别对Con组和NAFLD组中携带rs156265 CC基因型、携带 rs156265 CG基因型和携带rs156265 GG基因型的个体血清VLCFAs百分含量及血脂(TG、TC)的差异进行分析，结果显示：在Con组中，携带rs156265 CC基因型，携带rs156265 CG基因型和携带rs156265 GG基因型的个体血清VLCFAs百分含量以及TG、TC变化不明显，三组间差异均无统计学意义。在NAFLD组中，与携带rs156265 CC基因型的个体比较，携带rs156265 GG基因型的个体C22:0、DPA降低，P<0.05；其余VLCFAs百分含量以及TG、TC变化不明显，三组间差异无统计学意义。
　　7.ACOX1基因的单体型CCG对VLCFAs和血脂影响的分析
　　按照是否携带单体型CCG分别对Con组和NAFLD组中携带单体型CCG的个体和不携带单体型CCG的个体血清VLCFAs百分含量以及血脂(TG、TC)的差异进行了分析。结果显示：在Con组中，与不携带单体型CCG的个体比较，携带单体型CCG的个体DTA降低，P<0.05；对其他VLCFAs百分含量以及TG、TC没有影响；在NAFLD组中，与不携带单体型CCG的个体比较，携带单体型CCG的个体DTA、DHA、总VLCFAs降低，P<0.05；对其他VLCFAs百分含量以及TG、TC没有影响。
　　小结：
　　1.在中国北方汉族人群中，首次发现ACOX1基因的rs12430位点与NAFLD的易感性负相关，rs12430次要等位基因T为NAFLD的保护性因素。
　　2.在中国北方汉族人群中，首次发现ACOX1基因由rs12430-rs7219716-rs8065144构成的单体型CCG与NAFLD的易感性正相关，为NAFLD的危险因素。
　　3.在中国北方汉族人群中，首次发现ACAA1基因的rs156265位点与NAFLD的易感性正相关，rs156265次要等位基因纯合子基因型 GG为NAFLD的危险因素。
　　第四部分：单核苷酸多态性对过氧化物酶体脂肪酸β-氧化关键酶基因表达的影响
　　目的：
　　从基因表达角度探讨rs156265 C>G影响NAFLD发病风险的分子机制
　　方法：
　　提取人全血总 RNA，分离外周血白细胞，检测携带 rs156265不同基因型个体ACAA1在mRNA和蛋白水平的表达。
　　结果：
　　1.携带rs156265不同基因型的个体ACAA1 mRNA的表达变化
　　ACAA1mRNA在人外周血白细胞有低水平的表达。
　　正常人群中，携带rs156265 CC基因型，携带rs156265 CG基因型和携带rs156265 GG基因型的个体外周血白细胞中ACAA1 mRNA的相对表达量变化不明显，三组间差异均无统计学意义(P＞0.05)。
　　NAFLD人群中，携带rs156265 CC基因型，携带rs156265 CG基因型和携带rs156265 GG基因型的个体外周血白细胞中ACAA1 mRNA的相对表达量变化不明显，三组间差异均无统计学意义。
　　2.携带 rs156265不同基因型的个体 ACAA1蛋白(PTH1)水平的表达变化
　　Western blot结果显示，与携带rs156265 CC基因型的个体比较，携带rs156265 CG和GG基因型的个体外周血白细胞中PTH1蛋白含量均明显减少。
　　小结：
　　1.携带rs156265(CG+GG)基因型的个体ACAA1基因蛋白水平表达下降。
　　2.ACAA1蛋白水平下降可能与携带rs156265 GG基因型的NAFLD人群C22:0的降低无关。
　　结论：
　　1.C16:0、C16:1n-7、C18:1n-9、C18:3n-3(ALA)与NAFLD的患病风险呈正相关，是 NAFLD的危险因素；C18:0、C20:0、C22:0、C24:0、C18:2n-6(LA)、C20:4n-6(AA)、C22:6n-3(DHA)与NAFLD的患病风险呈负相关，是NAFLD的保护因素。
　　2.在中国北方汉族人群中，首次发现 FADS2基因的rs174602和ACOX1基因的rs12430与NAFLD的易感性负相关，rs174602次要等位基因G和rs12430次要等位基因T为NAFLD的保护性因素；ACAA1基因的rs156265与NAFLD的易感性正相关，rs156265次要等位基因纯合子基因型GG为NAFLD的危险因素。
　　3.在中国北方汉族人群中，首次发现FADS1-FADS2基因簇的MiA单体型GGG(rs174545-rs2072114-rs174602)与NAFLD的易感性负相关，为NAFLD的保护性因素；ACOX1基因的单体型CCG(rs12430-rs7219716-rs8065144)与NAFLD的易感性正相关，为NAFLD的危险因素。。
　　4.携带rs156265(CG+GG)基因型的个体ACAA1基因蛋白水平表达下降。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分非酒精性脂肪性肝病人群血清脂肪酸谱及去饱和酶活性分析

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分FADS1-FADS2基因多态性与非酒精性脂肪性肝病及其血清PUFAs变化的关联性研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分过氧化物酶体脂肪酸β-氧化关键酶基因多态性与非酒精性脂肪性肝病及其血清VLCFAs变化的关联性研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分单核苷酸多态性对过氧化物酶体脂肪酸β-氧化关键酶基因表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:非酒精性脂肪性肝病与相关基因的多态性

致谢

个人简历