北沙参在大鼠体内代谢物的鉴定与北沙参-麦冬配伍的药物动力学研究

摘要

北沙参为伞形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.的干燥根，为临床常用中药。《中国药典》记载其具有养阴清肺、益胃生津的功效，可用于治疗肺热燥咳、劳嗽痰血、热病津伤口渴等症。香豆素是北沙参中的一类主要活性成分，种类多样。目前为止，北沙参中香豆素类成分在体内的代谢物尚无系统的研究。中药本身成分复杂，进入体内后组成更为复杂，且含量较低。如何在如此复杂的体系中准确、快速地鉴定中药进入体内的成分，成为中药能否深入研究的关键。UPLC/qTOF-MS技术灵敏度高、分离能力强，能够提供准确的分子量，并预测元素组成，成为中药进入体内后的成分及其代谢物的定性与定量研究的有力工具。本研究即采用该技术，建立一种普适性的中药体内代谢物发现和鉴定的有效方法，并用于北沙参提取液在大鼠尿液、胆汁和血浆中的代谢物的鉴定，推测可能的代谢途径。
　　北沙参和麦冬均是滋阴清热之中药，临床配伍应用历史悠久。两药相辅相成，相须为用，肺胃心三脏同治，其功效更著。两药配伍机制目前尚无相关报道。本研究采用UPLC/qTOF-MS技术，对单独给与北沙参和麦冬以及两药配伍给与大鼠后主要成分的药物动力学进行研究，为其配伍机制的阐明奠定基础。
　　第一部分北沙参在大鼠体内吸收组分与其代谢物的鉴定
　　目的:采用UPLC/qTOF-MS技术，建立一种普适性的中药体内代谢物发现和鉴定的有效方法，并用于北沙参在大鼠尿液、血浆和胆汁中代谢物的鉴定。
　　方法:
　　1北沙参灌胃提取液的制备:将北沙参按照传统水煎工艺提取，减压浓缩至相当于0.4 g/mL北沙参，加入4倍量无水乙醇沉淀，抽滤，减压除醇，用水稀释至相当于2 g/mL的原药材。
　　2生物样品的采集和预处理:取9只雄性Sprague-Dawley大鼠，体重250±10 g，随机分为3组，每组3只，按体重以1 mL/100 g的给药量，灌胃给与大鼠，分别采集给药后72 h的尿液、24 h的胆汁样品和0.17、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12和24 h时的血浆样品，分别合并所有的尿样、胆汁和血浆样品。将合并的生物样品分别用3倍量的乙酸乙酯萃取，萃取3次，每次10 min。合并乙酸乙酯层，减压干燥，残渣用甲醇溶解。
　　3样品分析条件:采用UPLC/qTOF-MS技术分析样品。色谱柱为Kinelex2.6μC18100A(1002.10 mm)（菲罗门），预柱为SecurityGuardUHPLC C18柱，流动相为甲醇和1mmol/L的乙酸铵水溶液，梯度洗脱;高分辨质谱采用ESI源，正离子模式，全扫描采集，采用动态背景扣除和信息依赖采集触发二级碎片的采集，每一循环采集8个最强峰的二级质谱图。运行时间为35 min。
　　4代谢物发现和鉴定的步骤:首先结合文献，建立北沙参中香豆素类已知化合物的信息库。然后用PeakView1.2软件寻找主要的吸收组分。再将这些吸收组分按照结构的相似性分类，选择每类中的典型化合物。接着采用Metabolitepilot1.5软件，对这些典型化合物进行分析，寻找尿样、胆汁和血浆样品中这些化合物的代谢物。最后根据香豆素类的裂解规律和化合物的极性，对这些代谢物的结构进行解析，推断可能的代谢产物，并推测可能的生物转化途径。
　　结果:通过PeakView1.2，在给药后的生物样品中寻找到20种主要的吸收组分;按结构将其分为5类，分别以东莨菪内酯、异茴芹内酯、欧前胡素、6-(3，3-二甲烯丙基)-7-羟基香豆素和异紫花前胡内酯为典型成分;利用Metabolitepilot1.5软件分析这些典型成分，寻找并初步鉴定其代谢物，共鉴定出111种成分，主要的代谢类型为氧化、甲基化、水解、氢化、和硫酸结合等。
　　结论:本研究采用UPLC/qTOF-MS技术，成功发现和鉴定了北沙参大鼠体内代谢物，为北沙参体内过程的阐明奠定了基础，同时为中药进入体内的成分分析提供了有效手段。
　　第二部分北沙参-麦冬配伍的药物动力学研究
　　目的:建立生物样品中北沙参和麦冬中主要成分的UPLC/qTOF-MS定量测定方法，研究北沙参-麦冬配伍给与大鼠的药物动力学特征，初步探讨二者配伍的药物动力学相互影响，为北沙参-麦冬配伍机制的阐明奠定基础。
　　方法:
　　1北沙参、麦冬和北沙参-麦冬配伍灌胃液的制备:按照传统水煎工艺，分别制备北沙参和麦冬的水提液。将此提取液分别减压浓缩8倍和4倍，进行冷冻干燥，得到北沙参和麦冬水提物粉末。加适量水溶解，分别制备成北沙参灌胃液（相当于1 g/mL的北沙参药材）、麦冬灌胃液（相当于1 g/mL的麦冬药材）、北沙参-麦冬灌胃液（相当于1g/mL的北沙参药材和1 g/mL的麦冬药材）。
　　2生物样品的采集和预处理:取18只270±20 g的雄性Sprague-Dawley大鼠，随机分为3组，按体重以2mL/100 g的给药量，分别灌胃给与上述3种溶液。分别于给药后0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36h眼内眦静脉丛取血，采用乙腈沉蛋白的方法处理血浆样品。
　　3样品分析条件:采用UPLC-Q-TOF技术。Phenomenex Kinetex2.6μC18100A(503.0 mm，2.6μm)色谱柱，柱前连接在线过滤器。流动相为0.03％乙酸和乙腈。ESI电离，子离子扫描模式，北沙参中补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、异茴芹内酯和欧前胡素在正离子模式下检测，麦冬中甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、甲基麦冬高异黄酮A和麦冬皂苷D在负离子模式下检测。采用高分辨的多重子离子加和的方法计算峰面积，并采用内标法加权（1/x2）一元线性回归定量。
　　4药物动力学研究与分析:根据测定结果，绘制药时曲线，采用非房室模型根据公式计算药物动力学参数，并比较单独给药和配伍给药的药物动力学差异。
　　结果:大鼠血浆中花椒毒素、佛手柑内酯、异茴芹内酯、欧前胡素、补骨脂素、麦冬皂苷D、甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B和甲基麦冬高异黄酮A分别在0.040～20 ng/mL、0.040～20 ng/mL、0.040～20 ng/mL、0.06～30 ng/mL、0.06～30 ng/mL、0.800～200 ng/mL、0.30～75 ng/mL、0.30～75 ng/mL和0.30～75 ng/mL范围内线性关系良好(r≥0.991)，最低定量限(LLOQ)≤0.04 ng/mL。批内、批间精密度的相对标准偏差(RSD)均小于10.1％，相对误差（RE）为-5.0％～8.7％。平均提取回收率为67.4％～105.5％，基质效应处于88.1％～112.5％范围内。北沙参和麦冬单次配伍给药可以提高佛手柑内酯、异茴芹内酯、补骨脂素、欧前胡素、麦冬皂苷D和甲基麦冬高异黄酮A的生物利用度，影响佛手柑内酯、异茴芹内酯和补骨脂素的体内过程，减慢甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的吸收。
　　结论:对药材水提取液进行冷冻干燥处理，可以长期保存提取物。建立的样品测定方法，快速、灵敏、专属、稳定，可以用于北沙参和麦冬在体内成分的测定。北沙参和麦冬配伍药物动力学的结果，为其配伍机制的研究奠定基础。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 北沙参在大鼠体内的吸收组分与其代谢物的鉴定

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 北沙参-麦冬配伍的药物动力学研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 液质联用技术在中药复杂体系成分鉴定中的应用

致谢

个人简历